XU1:2025/Dec: Difference between revisions
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<p> 上样3 100 µM DBCO-SA 1ul 稀释至 100ul | <p> 上样3 100 µM DBCO-SA 1ul 稀释至 100ul （1µM DBCO-SA），上样10ul<p> | ||
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<title>组会汇报</title> | |||
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<div class="date">2025年12月9日</div> | |||
<h1 class="title">制备TNF-SA-DNA</h1> | |||
<div class="content"> | |||
<p>1.样品稀释：生物素化TNF-α储存液 (63.4KDa 1µM)：10ul</p> | |||
<p> Azide-DNA储存液 (100 µM)：1管20ul冻存 | |||
<p> DBCO-SA储存液 (100 µM)：4ul冻存 <p> | |||
<p>2.反应1： 3ul DBCO-SA + 15ul Azide-DNA点击化学，冰上孵育5h<p> | |||
<p>3.稀释至 30ul 得到10uM SA-DNA,留5ul验证<p> | |||
<p>4.反应2： 10ul SA-DNA + 10ul 生物素化TNF-α，得到0.5uM TNF-SA-DNA冰上孵育1h<p> | |||
<p>5.Native Page<p> | |||
<p>6.1 上样1 1 µM 生物素化TNF-α 5ul 稀释至 10ul， <p> | |||
<p> 上样2 100 µM DBCO-SA 1ul 稀释至 100ul，再取5ul稀释至 10ul<p> | |||
<p> 上样3 10uM SA-DNA 5ul 稀释至 100ul <p> | |||
<p> 上样4 0.5uM TNF-SA-DNA 10ul<p> | |||
Revision as of 03:43, 8 December 2025
制备TNF-SA-DNA
1.样品稀释：生物素化TNF-α储存液 (63.4KDa 1µM)：20 µg粉末溶于317 µLdd水，分装出5管30ul冻存
Azide-DNA储存液 (100 µM)：10 µL 1mM + 90 µL dd水 分装出5管20ul冻存
DBCO-SA储存液 (100 µM)：将1 mg DBCO-SA冻干粉短暂离心。加入 149 µL 预冷dd水，分装出5管5ul冻存
2.反应1： 3ul DBCO-SA + 15ul Azide-DNA点击化学，室温孵育4h
3.10kda超滤管超滤除去游离DNA超滤至 30ul 得到10uM SA-DNA,留5ul验证
4.反应2： 25ul SA-DNA + 25ul 生物素化TNF-α，室温孵育30min
5.100kda超滤管超滤除去游离蛋白超滤至 50ul 得到0.5uM TNF-SA-DNA
6.Native Page
6.1 上样1 1 µM 生物素化TNF-α 5ul 稀释至 10ul，
上样2 100 µM DBCO-SA 1ul 稀释至 100ul，再取5ul稀释至 10ul
上样3 10uM SA-DNA 5ul 稀释至 100ul
上样4 0.5uM TNF-SA-DNA 10ul
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蛋白验证
1.样品：生物素化TNF-α储存液 (63.4KDa 1µM)：1管25ul冻存
DBCO-SA储存液 (100 µM)：1管5ul冻存
2.Native Page
上样1 1 µM 生物素化TNF-α 10ul ，
上样2 1 µM 生物素化TNF-α 取5ul稀释至 10ul
上样3 100 µM DBCO-SA 1ul 稀释至 100ul （1µM DBCO-SA），上样10ul
上样4 1µM DBCO-SA 再取5ul稀释至 10ul
制备TNF-SA-DNA
1.样品稀释：生物素化TNF-α储存液 (63.4KDa 1µM)：10ul
Azide-DNA储存液 (100 µM)：1管20ul冻存
DBCO-SA储存液 (100 µM)：4ul冻存
2.反应1： 3ul DBCO-SA + 15ul Azide-DNA点击化学，冰上孵育5h
3.稀释至 30ul 得到10uM SA-DNA,留5ul验证
4.反应2： 10ul SA-DNA + 10ul 生物素化TNF-α，得到0.5uM TNF-SA-DNA冰上孵育1h
5.Native Page
6.1 上样1 1 µM 生物素化TNF-α 5ul 稀释至 10ul，
上样2 100 µM DBCO-SA 1ul 稀释至 100ul，再取5ul稀释至 10ul
上样3 10uM SA-DNA 5ul 稀释至 100ul
上样4 0.5uM TNF-SA-DNA 10ul