West Blot
阶段一 样品制备
BCA定量蛋白[edit]
- 400000细胞密度接种于6孔细胞培养板，分别于2ml RPMI完全培养基（PBS、LMWH、AST、LANPs(ug/ml)）中培育12h
- 收集细胞，用细胞核/细胞质蛋白提取试剂盒分别提取各组蛋白质样品(用RIPA裂解缓冲液裂解细胞20 mg--100~200 ul),(4℃10000-14000离心10-15 min)，用BCA蛋白浓度测定试剂盒对蛋白质进行浓度定量
- 蛋白样品与SDS-PAGE上样缓冲液(5×)按体积比4：1均匀混合，沸水浴10min，冷却后，将各组蛋白用缓冲液(1×)稀释至同一浓度备用(-80℃保存)
- 400000细胞密度接种于6孔细胞培养板，分别于2ml RPMI完全培养基（PBS、LMWH、AST、LANPs(ug/ml)）中培育12h
- 收集细胞，用细胞核/细胞质蛋白提取试剂盒分别提取各组蛋白质样品(用RIPA裂解缓冲液裂解细胞20 mg--100~200 ul),(4℃10000-14000离心10-15 min)，用BCA蛋白浓度测定试剂盒对蛋白质进行浓度定量
- 蛋白样品与SDS-PAGE上样缓冲液(5×)按体积比4：1均匀混合，沸水浴10min，冷却后，将各组蛋白用缓冲液(1×)稀释至同一浓度备用(-80℃保存)
- BCA:A液 B液 蛋白标准样品(蛋白浓度0125-2 mg/ml)
- 测定：a.每孔加入10 ul样品(96孔板) b.加入200 ul工作液振摇(30 S) c.37℃孵育0.5h(时间越久，温度越高，测量值越高) d.562nm酶标仪测量 e.标准曲线 f.恒温加热器100℃ 5-10 min ,分装保存(-40℃)
配置溶液[edit]
- 1.细胞裂解液=RIPA细胞裂解液：PMSF(100mmol/L异丙醇溶液)=100：1
- 2.分离胶、浓缩胶-说明书
- 3.电泳缓冲液(1.5 L):4.545 g Tris,21.6 g Glycine,1.5 g SDS,1500 ml UP水；转膜缓冲液(1.5 L):4.545 g Tris,21.6 g Glycine至1200mlUP水,300 ml 甲醇
- 4.TBST(1.5 L):3.63 g Tris,12 g NACL至1500 ml UP水,加7.5 ml 吐温-20(0.5/%),5mol/L HCL 调节PH至7.6
- 蛋白上样缓冲溶液（5×)
阶段二 制胶[edit]
- 组装制胶装置
- 配置分离胶(说明书)
- 灌胶：用1 ml移液枪加下层胶,沿一边灌至绿色下缘线，再加左右滑动上层胶至玻璃板边缘，立即慢慢插入梳子，上下层 胶分界线与梳子底部至少大于0.5 cm，放置37 ℃烘箱20 min，等待胶凝固同时配置电泳缓冲溶液
- 转移至电泳槽中，短板向内，加入电泳缓冲液至2 gel刻度线，取出玻璃板放入电泳缓冲液中，补满小槽内缓冲液，加大槽缓冲液4 gel处，两槽需有液面高度差，再慢慢拔出梳子
- 上样：两边孔弃用或者加Loading buffer，避免边缘效应，上样前可用电泳缓冲液稀释各样品至体积一致，Marker和Loading buffer以1：1混合，Marker 8 ul + 缓冲液 2 ul，不上样的孔加Loading buffer 10 ul
- 电泳：点 Manual 点 V,90 V 恒压，小槽内有许多气泡向上跑，RUN，进入分离胶越50 min，进入分离胶后可调至 150 V，等待时配置转膜缓冲液
阶段三 转膜[edit]
- 剪下合适大小PVDF膜，甲醇浸泡3min，膜的右上角剪一下，用于判断方向，放入缓冲液(凝胶在转膜液中浸泡5min，用于平衡离子)
- 转膜(黑下白上)：海绵垫+3层滤纸+PVDF膜+凝胶+3层滤纸+海绵垫+黑色板(放置时黑对黑)
- 4℃，3000 mA转膜60 min(需要大量冰袋，碎冰)等待时配制TBST，5%脱脂奶
阶段四 抗体孵育染色[edit]
- 转膜后于5%脱脂奶(2 g脱脂奶粉加40 mlTBST)中封闭2 h(37℃，80 rmp），每一格加入5 ml 5%脱脂奶
- TBST洗5 min×5次
- 一抗用3%脱脂奶(1.5 g脱脂奶加50 mlTBST)稀释(1格4-5 ml)
- 37℃孵育1 h并4℃过夜或37℃ 2 h,回收一抗，保存在-20℃,每次用前加一点(YAP 1 ul)
- TBST洗5 min×5
- 二抗用3%脱脂奶(1.5 g脱脂奶加50 mlTBST)
- 37℃孵育1 h,TBST洗5 min×5
- 显色：葆光Millipore Immobilon western 显色=黑色：白色=1：1，一般各加1 ml，配成2 ml显影液
阶段一 样品制备
BCA定量蛋白[edit]
- 400000细胞密度接种于6孔细胞培养板，分别于2ml RPMI完全培养基（PBS、LMWH、AST、LANPs(ug/ml)）中培育12h
- 收集细胞，用细胞核/细胞质蛋白提取试剂盒分别提取各组蛋白质样品(用RIPA裂解缓冲液裂解细胞20 mg--100~200 ul),(4℃10000-14000离心10-15 min)，用BCA蛋白浓度测定试剂盒对蛋白质进行浓度定量
- 蛋白样品与SDS-PAGE上样缓冲液(5×)按体积比4：1均匀混合，沸水浴10min，冷却后，将各组蛋白用缓冲液(1×)稀释至同一浓度备用(-80℃保存)
- 400000细胞密度接种于6孔细胞培养板，分别于2ml RPMI完全培养基（PBS、LMWH、AST、LANPs(ug/ml)）中培育12h
- 收集细胞，用细胞核/细胞质蛋白提取试剂盒分别提取各组蛋白质样品(用RIPA裂解缓冲液裂解细胞20 mg--100~200 ul),(4℃10000-14000离心10-15 min)，用BCA蛋白浓度测定试剂盒对蛋白质进行浓度定量
- 蛋白样品与SDS-PAGE上样缓冲液(5×)按体积比4：1均匀混合，沸水浴10min，冷却后，将各组蛋白用缓冲液(1×)稀释至同一浓度备用(-80℃保存)
- BCA:A液 B液 蛋白标准样品(蛋白浓度0125-2 mg/ml)
- 测定：a.每孔加入10 ul样品(96孔板) b.加入200 ul工作液振摇(30 S) c.37℃孵育0.5h(时间越久，温度越高，测量值越高) d.562nm酶标仪测量 e.标准曲线 f.恒温加热器100℃ 5-10 min ,分装保存(-40℃)
配置溶液[edit]
- 1.细胞裂解液=RIPA细胞裂解液：PMSF(100mmol/L异丙醇溶液)=100：1
- 2.分离胶、浓缩胶-说明书
- 3.电泳缓冲液(1.5 L):4.545 g Tris,21.6 g Glycine,1.5 g SDS,1500 ml UP水；转膜缓冲液(1.5 L):4.545 g Tris,21.6 g Glycine至1200mlUP水,300 ml 甲醇
- 4.TBST(1.5 L):3.63 g Tris,12 g NACL至1500 ml UP水,加7.5 ml 吐温-20(0.5/%),5mol/L HCL 调节PH至7.6
- 蛋白上样缓冲溶液（5×)
阶段二 制胶[edit]
- 组装制胶装置
- 配置分离胶(说明书)
- 灌胶：用1 ml移液枪加下层胶,沿一边灌至绿色下缘线，再加左右滑动上层胶至玻璃板边缘，立即慢慢插入梳子，上下层 胶分界线与梳子底部至少大于0.5 cm，放置37 ℃烘箱20 min，等待胶凝固同时配置电泳缓冲溶液
- 转移至电泳槽中，短板向内，加入电泳缓冲液至2 gel刻度线，取出玻璃板放入电泳缓冲液中，补满小槽内缓冲液，加大槽缓冲液4 gel处，两槽需有液面高度差，再慢慢拔出梳子
- 上样：两边孔弃用或者加Loading buffer，避免边缘效应，上样前可用电泳缓冲液稀释各样品至体积一致，Marker和Loading buffer以1：1混合，Marker 8 ul + 缓冲液 2 ul，不上样的孔加Loading buffer 10 ul
- 电泳：点 Manual 点 V,90 V 恒压，小槽内有许多气泡向上跑，RUN，进入分离胶越50 min，进入分离胶后可调至 150 V，等待时配置转膜缓冲液
阶段三 转膜[edit]
- 剪下合适大小PVDF膜，甲醇浸泡3min，膜的右上角剪一下，用于判断方向，放入缓冲液(凝胶在转膜液中浸泡5min，用于平衡离子)
- 转膜(黑下白上)：海绵垫+3层滤纸+PVDF膜+凝胶+3层滤纸+海绵垫+黑色板(放置时黑对黑)
- 4℃，3000 mA转膜60 min(需要大量冰袋，碎冰)等待时配制TBST，5%脱脂奶
阶段四 抗体孵育染色[edit]
- 转膜后于5%脱脂奶(2 g脱脂奶粉加40 mlTBST)中封闭2 h(37℃，80 rmp），每一格加入5 ml 5%脱脂奶
- TBST洗5 min×5次
- 一抗用3%脱脂奶(1.5 g脱脂奶加50 mlTBST)稀释(1格4-5 ml)
- 37℃孵育1 h并4℃过夜或37℃ 2 h,回收一抗，保存在-20℃,每次用前加一点(YAP 1 ul)
- TBST洗5 min×5
- 二抗用3%脱脂奶(1.5 g脱脂奶加50 mlTBST)
- 37℃孵育1 h,TBST洗5 min×5
- 显色：葆光Millipore Immobilon western 显色=黑色：白色=1：1，一般各加1 ml，配成2 ml显影液