常用细胞房操作
更换培养基
- 更换频率1次/d。
- 弃去旧培养基：
- 贴壁细胞（如癌细胞）：移液枪直接吸取培养基并弃去；
- 悬浮细胞：收集原培养基及cell置于EP管中，离心，弃上清：
- 半贴壁细胞：采用半换液，倾斜孔板或培养皿，移液枪吸取上层培养基弃去。
- 加入新鲜培养基。培养基总量：10cm 培养皿6-10m。
| 培养器皿 | 每孔表面积 (cm²) |
每孔培养基的 体积（ml） |
贴壁细胞转染前一天 接种密度 |
悬浮细胞转染当 天接种密度 |
|---|---|---|---|---|
| 96孔板 | 0.3 | 0.1 | 5000±2500 | 2-5×105 |
| 24孔板 | 2 | 0.5 | 25000±10000 | 1-2.5×105 |
| 12孔板 | 4 | 1 | 50000±20000 | 2-5×105 |
| 6孔板 | 10 | 2 | 150000±50000 | 0.4-1×106 |
| 60mm培养皿 | 20 | 4 | 400000±100000 | 1-2.5×106 |
| 100mm培养皿 | 60 | 10 | 1×106±250000 | 2-5×106 |
| *：乙醇待水溶液体系完全溶解后再加入 | ||||
12孔板CELL铺板（给药用）
- 细胞类型：肿瘤细胞(人源)（贴壁cell）
- 操作
- 取培养皿，弃去培养基，加入2ml PBS清洗，弃去
- 加入2 mL胰酶，37 ℃消化2 min。
- 加含血清培养基2 mL（终止胰酶消化），转移至EP管中，离心，弃去上清，
- 加入培养基重悬，先向12孔板中每一孔加入0.5 mL含血清培养基，再添加0.5 mL cell重悬液（培养基）。先铺1孔，显微镜观察密度，根据需求调整重悬液或稀释液的体积。轻微晃匀，注明cell、操作、日期。
- 37℃孵育过夜。过夜后，细胞密度达到70-80%时给药。
- 备注：
- 铺板前可以先在试管中混匀cell再铺板，更均匀。
- 胰酶消解时间取决于cell种类。过度消化会导致细胞膜蛋白损伤，影响细胞膜完整性和细胞贴壁；过度消化可能会使细胞聚集成团，需后续操作吹散，否则会影响细胞状态；过度消化会影响细胞表面受体的功能和完整性，从而影响细胞正常信号传导和功能表达。
- 一般一皿长满的肿瘤细胞可铺3块板(6 12 24孔板)，但是96孔板周围一圈的只添加PBS，仅在中心的60个孔铺细胞，60孔共铺约1/10 or 1/12 or 1/15皿细胞。因为本次实验的人源细胞生长比较慢，所以一皿cell铺2.5块板
原理
- 胰酶
- 胰酶的作用原理
胰酶是一种具有底物特异性的蛋白水解酶。贴壁细胞通常通过一组蛋白质（整合素）黏附在培养容器表面或胞外基质上，胰酶可分解这些蛋白质。加入胰酶后，细胞从扁平的贴壁状态慢慢转变成游离的球形状态，这是因为细胞失去附着力，趋向于选择最小能量配置，即球形。一般情况下，会在胰酶中添加EDTA螯合剂，用于辅助破坏细胞之间的钙依赖连接。
- 血清失活胰酶
血清中含有一些能够中和或抑制胰酶活性的因子。如：
- 酶抑制蛋白：可以结合胰酶，抑制胰酶活性，有效终止胰酶对细胞的消化作用。
- 钙、镁离子：帮助稳定细胞膜和细胞间的连接，修复胰酶导致的细胞粘附力下降。
- 营养物质和生长因子：可修复受损的细胞膜，有助于维持细胞的正常生理状态，保障分离过程中的细胞活性和完整性。