蛋白提取及WB

• 前处理-蛋白提取；
• 分离：SDS-PAGE
• 成像：转膜、WB

蛋白提取

1. 移液枪转移12孔板中cell培养液到ep管中，底部留存部分液态培养基；
2. 胰酶或者细胞刮板分离底部粘璧cell，移液枪转移至上述ep管中。流式不可采用刮板，会损伤cell；刮板用PBS清洗；
3. 离心2k rpm 3min，弃去上清，PBS重悬，n合1，再次离心，弃上清，清洗cell
4. 按照12孔板每孔cell加入25 ul裂解液的比例向ep管加入cell裂解液，4 ℃裂解10-30min、离心15min。（6孔板每孔50ul裂解液）
5. 用上清稀释loading buffer(按照loading buffer 的要求），金属浴or沸水浴 5 - 10min，防止ep管加热过程开盖
6. -40--80℃保存，防止降解

SDS-PAGE

1. 制胶
   1. 支架下方垫橡胶垫实现密封，薄板朝外装载玻璃板，吸头辅助夹紧

      File:SDS-PAGE制胶装置.jpeg

      SDS-PAGE制胶装置

   2. 配制电泳液：每次用量约1.5 L

1.5L SDS-PAGE电泳液组成
Reagent	Quantity (for 1.5 L)
Tris	4.545 g
甘氨酸	21.6 g
SDS	1.5 g
UP水	1.5 L

1. 1. 根据目标蛋白的分子量，按照制胶试剂说明书调配试剂，制作分离胶和浓缩胶，倒入玻璃板，插入梳子。

File:SDS-PAGE凝胶比例.jpeg

SDS-PAGE凝胶比例

1. 1. 凝固后，将玻璃板转移至电泳槽中，薄板向里，向夹层中倒入电泳液，验漏(是否夹紧，否则电泳时功率不稳)
   2. 拔出梳子，吸取电泳液清洗样品孔，排除残余胶液
   3. 上样及marker，一般1孔20ug，最多30ul；空余孔上样 1xloading buffer(电泳液稀释)
   4. 电泳电压：浓缩胶约80V,分离胶约150V
   5. 溴酚蓝迁移至凝胶2/3处即可停止电泳

File:SDS-PAGE电泳例图.jpeg

SDS-PAGE电泳例图

1. 转膜
   1. 转膜缓冲液的配制：

1.5L 转膜缓冲液组成
Reagent	Quantity (for 1.5 L)
Tris	4.545 g
甘氨酸	21.6 g
UP水	1.2 L
乙醇	300 mL*
*：乙醇待水溶液体系完全溶解后再加入

1. 1. 膜及其支撑膜浸入乙醇中活化5 min；
   2. 转膜缓冲液倒入盘中，各层预先在盘中浸透
   3. 按照2层泡沫-1层滤纸-gel(切割周围)-1层滤纸-2层泡沫，进行叠加，注意排出气泡，夹紧，放入电泳槽
   4. 电泳约1h

WB

File:WB实验.png

WB实验

1. 剪裁目标蛋白和参比蛋白的膜，浸入封闭液中，摇床15min
2. TBST配制：

0.5L TBST缓冲液组成
Reagent	Quantity (for 1.5 L)
Tris	1.21 g
NaCl	4 g
UP水*	0.5 L
吐温20**	2.5 mL（0.5%）
*：Tris和NaCl溶解后HCl调整pH至7.6（pH计） **：调完pH再加吐温，使用用特殊的枪和吸头

1. 弃封闭液 加一抗5ml，膜浸透，避免漂浮或粘壁，37度摇床1h，4℃过夜
2. 回收一抗，膜用TBST清洗5次，每次摇床5min后弃去，去除残余一抗
3. 加入二抗，37度摇床1h，TBST清洗5次
4. 使用314的BioRad凝胶成像系统，image lab软件，将缓冲液的膜浸泡至显影液中2min，转移至培养皿，放入样品盘，成像

备注

1. 实验操作：
   1. 制胶前用70%乙醇清洁并擦拭玻璃板。
   2. 内参一般不和样品同一块膜，单染方便抗体回收，只回收一抗，不回收二抗。一抗多为兔种属，二抗是抗兔的山羊抗，二抗基本只针对一抗的种属。抗体一般-20℃保存。
   3. 制好的胶尽快使用，不隔夜
   4. 上层溶液左中右位点均匀加入
   5. 该测定实验本身影响因素较多，所以n个重复合成一个样本进行SDS-PAGE，一组样本尽量一块凝胶进行分析。
   6. 预实验可省略bca，根据细胞密度简单确定上样体积，使用内参(cell固定表达蛋白，且相对量较为固定）进行相对定量

1. 其他：
   1. 该实验用于药效评估，药效前应当先做毒性实验
   2. 细胞裂解液的成分：pmsf
   3. 封闭液的组成：BSA或奶粉溶液

File:WB结果例图.jpeg

WB结果例图

原理

成像原理