蛋白提取及WB

目的

• 药效（药效前应当先做毒性）

蛋白提取

1. 移液枪转移12孔板中cell培养液到ep管中，底部留存部分液态培养基；
2. 胰酶或者细胞刮板分离底部粘璧cell，移液枪转移至上述ep管中。流式不可采用刮板，会损伤cell；刮板用PBS清洗；
3. 离心2k rpm 3min，弃去上清，PBS重悬，n合1，再次离心，弃上清，清洗cell
4. 按照12孔板每孔cell加入25 ul裂解液的比例向ep管加入cell裂解液，4 ℃裂解10-30min、离心15min。（6孔板每孔50ul裂解液）
5. 用上清稀释loading buffer(按照loading buffer 的要求），金属浴or沸水浴 5 - 10min，防止ep管加热过程开盖
6. -40--80℃保存，防止降解

SDS-PAGE

1. 制胶
   1. 支架下方垫泡沫垫实现密封，装载制胶板，（吸头辅助夹紧）

File:SDS-PAGE制胶装置.jpeg

SDS-PAGE制胶装置

1. 1. 根据制胶试剂说明书调配试剂，制作分离胶和浓缩胶，倒入制剂搬，插入梳子。
   2. 配制电泳液：每次用量约1.5 L

1.5L SDS-PAGE电泳液组成
Reagent	Quantity (for 1.5 L)
Tris	4.545 g
甘氨酸	21.6 g
SDS	1.5 g
UP水	1.5 L

细胞裂解液的成分：pmsf