蛋白提取及WB: Difference between revisions
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##根据制胶试剂说明书调配试剂，制作分离胶和浓缩胶，倒入制剂搬，插入梳子。 | ##根据制胶试剂说明书调配试剂，制作分离胶和浓缩胶，倒入制剂搬，插入梳子。 | ||
Revision as of 01:39, 7 July 2025
目的
- 药效（药效前应当先做毒性）
蛋白提取
- 移液枪转移12孔板中cell培养液到ep管中，底部留存部分液态培养基；
- 胰酶或者细胞刮板分离底部粘璧cell，移液枪转移至上述ep管中。流式不可采用刮板，会损伤cell；刮板用PBS清洗；
- 离心2k rpm 3min，弃去上清，PBS重悬，n合1，再次离心，弃上清，清洗cell
- 按照12孔板每孔cell加入25 ul裂解液的比例向ep管加入cell裂解液，4 ℃裂解10-30min、离心15min。（6孔板每孔50ul裂解液）
- 用上清稀释loading buffer(按照loading buffer 的要求），金属浴or沸水浴 5 - 10min，防止ep管加热过程开盖
- -40--80℃保存，防止降解
SDS-PAGE
- 制胶
- 支架下方垫橡胶垫实现密封，装载制胶板，吸头辅助夹紧
- 根据制胶试剂说明书调配试剂，制作分离胶和浓缩胶，倒入制剂搬，插入梳子。
- 配制电泳液：每次用量约1.5 L
| 1.5L SDS-PAGE电泳液组成 | |
|---|---|
| Reagent | Quantity (for 1.5 L) |
| Tris | 4.545 g |
| 甘氨酸 | 21.6 g |
| SDS | 1.5 g |
| UP水 | 1.5 L |
细胞裂解液的成分：pmsf