XIE/2:2026/Jan: Difference between revisions
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*取2 ul(1mM) TCEP, | *取2 ul(1mM) TCEP,用 PBS(7.4) 稀释至 20 ul(100uM),取 5 ul稀释后的 TCEP ，加入 85 ul PBS(7.40)，涡旋混匀---TCEP溶液pH过低提前中和 | ||
*取2 ul(50uM) | *取2 ul(50uM)抗体，用 PBS（pH 7.4）稀释至 10 ul（10uM），将 TECP 的 PBS 缓冲液加入其中，37℃ 孵育 2 h. | ||
*取1 ul(50uM) | *取1 ul(50uM)抗体，用 PBS（pH7.4）稀释至 8 ul，作为 C 组 | ||
==偶联== | ==偶联== | ||
* | *将孵育好的溶液用 PBS(6.5) 洗涤4次（10000g 3.5min），均分样品（A.B）----buffer pH 6.5避免后续加入的Mal被水解（碱性易水解） | ||
*A（共混组）：向 A | *A（共混组）：向 A 中加入 5 ul(100uM) 的 Mal-PEg-DBCO 和 1 ul(1mM) Azide-ssDNA，室温避光孵育 4 h. | ||
*B（依次组）：1）向 B | *B（依次组）：1）向 B 中加入 5 ul(100uM) 的 Mal-PEg-DBCO，室温避光孵育 2 h. 2)孵育结束后，向其加入1 ul(1mM) Azide-ssDNA，室温避光孵育 2 h. | ||
===验证=== | ===验证=== | ||
* | *强还原断开轻重链：向A、B、C中加入对应量的蛋白 loudingbuffer ，再各加入1 ulβ-巯基乙醇，100℃煮 10m in | ||
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Revision as of 14:41, 13 January 2026
1.13
抗体还原
- 取2 ul(1mM) TCEP,用 PBS(7.4) 稀释至 20 ul(100uM),取 5 ul稀释后的 TCEP ，加入 85 ul PBS(7.40)，涡旋混匀---TCEP溶液pH过低提前中和
- 取2 ul(50uM)抗体，用 PBS（pH 7.4）稀释至 10 ul（10uM），将 TECP 的 PBS 缓冲液加入其中，37℃ 孵育 2 h.
- 取1 ul(50uM)抗体，用 PBS（pH7.4）稀释至 8 ul，作为 C 组
偶联
- 将孵育好的溶液用 PBS(6.5) 洗涤4次（10000g 3.5min），均分样品（A.B）----buffer pH 6.5避免后续加入的Mal被水解（碱性易水解）
- A（共混组）：向 A 中加入 5 ul(100uM) 的 Mal-PEg-DBCO 和 1 ul(1mM) Azide-ssDNA，室温避光孵育 4 h.
- B（依次组）：1）向 B 中加入 5 ul(100uM) 的 Mal-PEg-DBCO，室温避光孵育 2 h. 2)孵育结束后，向其加入1 ul(1mM) Azide-ssDNA，室温避光孵育 2 h.
验证
- 强还原断开轻重链：向A、B、C中加入对应量的蛋白 loudingbuffer ，再各加入1 ulβ-巯基乙醇，100℃煮 10m in
- 10% SDS-Page.