XIE/Enzyme:2025/Nov

日期 11.3

1. GDH

取 GDH 1.4 mg，溶解于 2 mL PBS (1×) 中，形成 20 μM 溶液。 分装于离心管（每管 30 μL，共 4 管），以及 EP 管（400 μL、600 μL、800 μL 各一管）。 取其中 30 ul 管，加入 90 mL PBS (1×, 5 μM)。 取 100 μL 作为待反应液，剩余 20 μL 作为凝胶对照液。

2. DBCO

称取 DBCO 5 mg，加入 50 μL DMF (100 mM) 溶解。 取 2 μL 稀释至 20 μL (10 mM)。

3. Oligo

分别向 Seq1、Seq2 中加入UP 水：

• Seq1: 124 μL (1 mM)
• Seq2: 79 μL (1 mM)

各分装离心管 3 支，每支 20 μL。

4.反应

1. 取 DBCO 溶液(10 mM) 1 ul 加入待反应溶液，室温下，抽屉内避光孵育 5 h
2. 反应后的溶液，超滤离心 2000 转 3 min 25 ℃ , 吸取离心后上清液并稀释至 90 ul ，二次清洗液 90 ul
3. 加入 Seq1 (1 mM) 10 ul 于上清液中，抽屉中孵育过夜

日期 11.4

600X

1. nativepage

• 制胶：配置胶液（浓度9%） 1 X TBE 溶液
• 上样：上样前 吹去孔中杂质，上样 7 孔（Marker、纯蛋白液、样品液、超滤洗液、Marker 、蛋白缓冲、蛋白缓冲）
• 跑胶：120 V

2. 考马斯亮蓝染色

1. 切取胶体，于培养皿中注入 10 ml 考马斯亮蓝 ，37 ℃ 摇床振摇 3 h
2. 吸出培养皿中的考马斯亮蓝溶液，置于 15 ml 离心管 4°存储备用；用 UP 水反复清洗胶体基底至原色。

总结 1. 超滤时间过短，未有滤液 2. TBE 溶液 未调 PH 3. 用枪混乱，量不准

日期 11.5

• S1-GDH 杂交——超滤与否

1. 反应1：取 30 ul GDH 溶液，加入 PBS 90 ul稀释, 取 100 ul 加入 1 ul DBCO 反应，剩余作为 对照 1 避光孵育
2. 将样品平均分为两份（超滤组、未滤组），超滤组 12000 转 20 min
3. 反应2：分别向以上两组样品中各加入 5 ul S1 避光孵育过夜

• S1-GDH 杂交——中间体验证

1. 反应1：取 30 ul GDH 溶液，加入 PBS 90 ul稀释, 取 100 ul 加入 1 ul DBCO 反应，剩余作为 对照 2' 避光孵育4 h
2. 中产物：，样品 12000 转 20 min 超滤 ，保留样品 20 ul作为 中间产物对照
3. 反应2：吸出超滤液，少量多次清洗滤管，收集清洗液并保持体积为 80 ul ，加入 S1 8 ul 孵育过夜

日期 11.6

• Native page 验证

1. 配置胶液（浓度7.5%-Acr 2 ml）、1X TEB 1.5 L溶液
2. 跑胶 120 V 8 孔（对照1、未滤组、超滤组、Marker 、Marker、对照2、中间产物、样品）
3. 考马斯亮蓝染色

400X

日期 11.10

• RuCHMO - S2

1. 稀释 RuCHMO :取RuCHMO原液 100 ul，用PB Buffer稀释至 564 ul(5 uM),分至 4 管 每管140 ul
2. 反应 1：取 1 管 RuCHMO ,吸取 '100 ul ，加入 1 ul DBCO 溶液.剩余作为空白对照，在4℃，冰浴条件下孵育 4 h
3. 超滤 ：4℃ 12000 转 超滤 20 min ,清洗并稀释至 90 ul
4. 反应 2：向样品溶液中加入 10 ul S2, 4℃ 冰浴 过夜

日期 11.11

• Native page 验证

1. 配置胶液（浓度7.5%-Acr 2 ml）、1X TEB 1.5 L溶液
2. 跑胶 120 V 5 孔（Marker、样品、对照1、对照2 、Marker）
3. 考马斯亮蓝染色

11.11

日期 11.12

• RuCHMO - S2

1. 反应 1：取 1 管 RuCHMO ,吸取 '100 ul ，加入 1 ul DBCO 溶液.剩余作为空白对照，在4℃，冰浴条件下孵育 4 h
2. 超滤 ：4℃ 12000 转 超滤 20 min ,清洗并稀释至 100 ul，取 30 ul 保留作为 中间体对照
3. 反应 2：向剩余溶液中加入 10 ul S2, 4℃ 冰浴 过夜

日期 11.13

• Native page 验证

1. 配置胶液（浓度7.5%-Acr 2 ml）、1X TEB 1.5 L溶液
2. 跑胶 120 V 5 孔（Marker、对照、样品、中间体 、Marker）

11.13

日期 11.15

• RuCHMO-S2 蛋白条带消失原因

1. 分组

PBS 缓冲组

-80° 保存	常规对照	未超滤组		超滤组
		中间体	终产物	中间体	终产物
C1	C2	M1	R1	M2	R2

PB 缓冲组

-80° 保存	常规对照	未超滤组		超滤组
		中间体	终产物	中间体	终产物
C1'	C2'	M1'	R1'	M2'	R2'