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== Protocol (版本 1.0) ==
== Protocol (版本 1.0) ==
===<big>''' 一、酶-核酸杂交体的制备 '''</big>===
* '''<big><span style="color:red;">GDH-Oligo</span></big>
<div style="color: black !important; font-family: 'Times New Roman', SimSun, serif !important, line-height:1.5;">
=== 1. GDH 制备 ===
=== 1. GDH 制备 ===
取 '''17.5 μg GDH''' 溶解于 '''25 μL 1×PBS''' 中。
取 '''1.4 mg GDH''' 溶解于 '''2 mL 1×PBS''' 中。


=== 2. 稀释 GDH（样品液） ===
=== 2. 稀释 GDH（样品液） ===
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! 样品 !! 原样品浓度 !! 终样品浓度 !! 加入量 !! 总体积
! 样品 !! 原样品浓度 !! 终样品浓度 !! 加入量 !! 总体积
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|-
| GDH || 0.7 mg/mL || 0.175 mg/mL || 25 μL || 100 μL
|'''<span style="color:red;"> GDH </span>'''|| 0.7 mg/mL || 0.175 mg/mL || 25 μL || 100 μL
|}
|}


=== 3. 溶解 DBCO-PEG4-Bis-Sulfone 于 DMF(N,N-二甲基甲酰胺) 中（100 mM） ===
=== 3. 溶解 DBCO-PEG4-Bis-Sulfone 于 DMF(N,N-二甲基甲酰胺) 中（100 mM） ===
取'''  DBCO 2 mg''' 溶解'''DMF 20 ul''' 中


=== 4. 稀释 DBCO（样品液） ===
=== 4. 稀释 DBCO（样品液） ===
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! 样品 !! 原样品浓度 !! 终样品浓度 !! 加入量 !! 总体积
! 样品 !! 原样品浓度 !! 终样品浓度 !! 加入量 !! 总体积
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|-
| DBCO || 100 mM || 20 mM || 2 μL || 10 μL
| DBCO || 100 mM || 20 mM || 2 μL || 20 μL
|}
|}


=== 5. 向 GDH 样品液中加入 DBCO，并在室温下孵育 4 h ===
=== 5. 向 GDH 样品液中加入 DBCO，并在室温下孵育 4 h ===
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! 样品 !! 最终浓度 !! 分子量 !! 总摩尔量 !! Eq DBCO !! DBCO 摩尔量 !! DBCO 加入量 !! 总体积
! 样品 !! 最终浓度 !! 分子量 !! 总摩尔量 !! Eq DBCO !! DBCO 摩尔量 !! DBCO 加入量 !! 总体积
|-
|-
| GDH || 5 mM || 35 kDa || 0.5 nMol || 20 Eq || 10 nMol || 0.5 μL || 100 μL
| GDH || 5 μM || 35 kDa || 0.5 nMol || 20 Eq || 10 nMol || 1 μL || 100 μL
|}
|}


=== 6. 使用 10 kDa 超滤管超滤去除游离 DBCO ===
=== 6. 使用 10 kDa 超滤管超滤去除游离 DBCO ===
=== 7. Oligo ===
{| class="wikitable" style="text-align:center; width:80%"
! Name !! 序列 !! bp !! 修饰 !! Nmol/管 !! buffer (μL) !! 浓度 (mM)
|-
| S1 ||CTCTCCTTCTTCCCTTTCTTT|| 21 || 5'Azide || 123.53 || 123.53 || 1
|-
| S2 ||TTCGACAGCATGAACATCAGC|| 21 || 5'Azide || 97.51 || 97.51 || 1
|}


=== 7. 加入 Oligo，并在 37 ℃ 下孵育 4 h ===
{| class="wikitable" style="text-align:center; width:90%"
! 样品 !! 总摩尔量 !! Eq Oligo !! Oligo 摩尔量 !! S1 加入量 !! 总体积
|-
| GDH || 0.5 nMol || 20 Eq || 10 nMol || 10 μL || 100 μL
|}
*'''<big><span style="color:red;"> RuCHMO-Oligo</span></big>
=== 1. RuCHMO 制备===
{| class="wikitable" style="text-align:center;width:80%"
|-
! 样品 !! 初始浓度 !! 取样量 !! 最终浓度 !! 最终体积
|-
| '''<span style="color:red;">RuCHMO</span>''' || 28.2 μM || 100 μL || 5 μM || 564 μl
|}
* 最终样品 分为 '''4份''' 每份 '''140 ul'''
=== 2. 向 100 ul RuCHMO 样品液中加入 DBCO，'''4℃冰箱中冰浴孵育 4 h''' ===
{| class="wikitable" style="text-align:center; width:90%"
! 样品 !! 最终浓度 !! 分子量 !! 总摩尔量 !! Eq DBCO !! DBCO 摩尔量 !! DBCO 加入量 !! 总体积
|-
| RuCHMO || 5 μM || 65.45 kDa || 0.5 nMol || 20 Eq || 10 nMol || 1 μL || 100 μL
|}


=== 7. 加入 Oligo，并在 37 ℃ 下孵育 4 h ===
=== 3. 4 ℃, 12000 转, 超滤 20 min ===
=== 4. 加入 Oligo，并在 4 ℃冰箱 冰浴下孵育 过夜 ===
{| class="wikitable" style="text-align:center; width:90%"
{| class="wikitable" style="text-align:center; width:90%"
! 样品 !! 总摩尔量 !! Eq Oligo !! Oligo 摩尔量 !! Oligo 加入量 !! 总体积
! 样品 !! 总摩尔量 !! Eq Oligo !! Oligo 摩尔量 !! S1 加入量 !! 总体积
|-
| RuCHMO || 0.5 nMol || 20 Eq || 10 nMol || 10 μL || 100 μL
|}
 
===<big> '''二、Nativepage''' </big>===
[[File:reference_of_gel_concentration.jpg|thumb|600px|Reference]]
 
===1. 制胶 ===
{| class="wikitable"
|-
! 成分
! 体积/质量
|-
|-
| GDH || 0.5 nMol || 20 Eq || 10 nMol || 0.5 μL || 100 μL
| 30% ACR: Bis(29:1)
| 4.8 ml
|-
| Tris 1.5M
| 2 ml
|-
| 10% APS
| 80 ul
|-
| TEMED
| 8 ul
|-
| '''总'''
| '''8 ml'''
|}
|}


=== 8. 凝胶电泳 ===
'''注：''' 浓度'''(ACr)'''计算公式为 (30% × 4.8) / 8
等量的 '''GDH''' , '''偶联产物''' 和 '''Marker''' 跑胶，对蛋白进行'''考马斯亮蓝'''染色比对。
*'''1.5mol/L Tris (ph8.8):36.3g Tris /200 ml UP 水'''
*''' 10%APS:0.5 g APS / 5 ml UP 水，分装冻存
 
===2. 缓冲液配置 ===
* '''10X TBE (1L)'''
{| class="wikitable"
|-
! 成分
! 质量
|-
| Tris
| 54 g
|-
| EDTA-Na₂
| 3.72 g
|-
| 硼酸
| 27.5 g
|}
 
* 调节 PH 至 '''8.3'''
 
=== 3.上样液：蛋白缓冲液 = 4:1 ===
=== 4. 染色 ===
*切取胶体放置于含 '''10 ml 考马斯亮蓝'''培养皿中， '''37℃ 摇床振摇 3-4 h'''
*待颜色稳定后，吸出考马斯亮蓝溶液，可循环使用 2-3 次，用''' UP 水反复清洗至基底原色'''
 
== TME ==
=== Negative staining (uranyl acetate) ===
*'''Grid activation''': glow‑discharge copper grids for 30 s.
*'''Sample staining'''
#apply 4.5 µL of sample onto the grid.
#Blot off the sample, add buffer to the grid, then blot off the buffer.
#Prepare parafilm and place three drops of uranyl acetate (pH adjusted) on the parafilm.
#Quickly transfer the grid into a staining droplet, blot off excess, and incubate for 30 s.
#Air‑dry the grid.

Latest revision as of 09:05, 11 December 2025

Protein(RuCHMO/GDH) Conjugation to DNA Origami[edit]

Methods[edit]

Conjugation[edit]

  • Proteins containing 6x Histidine at the C terminus reacted, with the chemical DBCO-PEG4-Bis-sulfone(DPBS) for 4 h at room temperature. The bis-sulfone group reacts with the Histidines at the C terminus of the protein, and then an azide modified oligonucleotide is conjugated to the protein by click chemistry between the azide- and the DBCO-group.

Incubation[edit]

  • conjugation: DNA Origami = 20:1, and incubate in a PCR machine with a temperature ramp starting from 1 h at 37 ℃ follow by 14 h at 22 ℃, and immediately after incubation the nanopatterns are stored at 4 ℃.

Oligonucleotide Sequence[edit]

  • sequence(RuCHMO):CTCTCCTTCTTCCCTTTCTTT
  • Sequence(GDH):TTCGACAGCATGAACATCAGC

Protein[edit]

  • RuCHMO: 65.45 KDa
  • GDH: 35 KDa

Purification[edit]

  • 30 kDa MWCO 0.5 ml Amicon centrifugal filters (Milli-pore)

electro-phoresis[edit]

Sample
Reagent Sequence
DBCO-PEG4-Bis-sulfone
azide modified oligonucleotide CTCTCCTTCTTCCCTTTCTTT
azide modified oligonucleotide TTCGACAGCATGAACATCAGC

Protocol (版本 1.0)[edit]

一、酶-核酸杂交体的制备 [edit]

  • GDH-Oligo

1. GDH 制备[edit]

取 1.4 mg GDH 溶解于 2 mL 1×PBS 中。

2. 稀释 GDH（样品液）[edit]

样品 原样品浓度 终样品浓度 加入量 总体积
GDH 0.7 mg/mL 0.175 mg/mL 25 μL 100 μL

3. 溶解 DBCO-PEG4-Bis-Sulfone 于 DMF(N,N-二甲基甲酰胺) 中（100 mM）[edit]

取 DBCO 2 mg 溶解DMF 20 ul 中

4. 稀释 DBCO（样品液）[edit]

样品 原样品浓度 终样品浓度 加入量 总体积
DBCO 100 mM 20 mM 2 μL 20 μL

5. 向 GDH 样品液中加入 DBCO，并在室温下孵育 4 h[edit]

样品 最终浓度 分子量 总摩尔量 Eq DBCO DBCO 摩尔量 DBCO 加入量 总体积
GDH 5 μM 35 kDa 0.5 nMol 20 Eq 10 nMol 1 μL 100 μL

6. 使用 10 kDa 超滤管超滤去除游离 DBCO[edit]

7. Oligo[edit]

Name 序列 bp 修饰 Nmol/管 buffer (μL) 浓度 (mM)
S1 CTCTCCTTCTTCCCTTTCTTT 21 5'Azide 123.53 123.53 1
S2 TTCGACAGCATGAACATCAGC 21 5'Azide 97.51 97.51 1

7. 加入 Oligo，并在 37 ℃ 下孵育 4 h[edit]

样品 总摩尔量 Eq Oligo Oligo 摩尔量 S1 加入量 总体积
GDH 0.5 nMol 20 Eq 10 nMol 10 μL 100 μL
  • RuCHMO-Oligo

1. RuCHMO 制备[edit]

样品 初始浓度 取样量 最终浓度 最终体积
RuCHMO 28.2 μM 100 μL 5 μM 564 μl
  • 最终样品 分为 4份 每份 140 ul

2. 向 100 ul RuCHMO 样品液中加入 DBCO，4℃冰箱中冰浴孵育 4 h[edit]

样品 最终浓度 分子量 总摩尔量 Eq DBCO DBCO 摩尔量 DBCO 加入量 总体积
RuCHMO 5 μM 65.45 kDa 0.5 nMol 20 Eq 10 nMol 1 μL 100 μL

3. 4 ℃, 12000 转, 超滤 20 min[edit]

4. 加入 Oligo，并在 4 ℃冰箱 冰浴下孵育 过夜[edit]

样品 总摩尔量 Eq Oligo Oligo 摩尔量 S1 加入量 总体积
RuCHMO 0.5 nMol 20 Eq 10 nMol 10 μL 100 μL

二、Nativepage [edit]

Reference

1. 制胶[edit]

成分 体积/质量
30% ACR: Bis(29:1) 4.8 ml
Tris 1.5M 2 ml
10% APS 80 ul
TEMED 8 ul
总 8 ml

注： 浓度(ACr)计算公式为 (30% × 4.8) / 8

  • 1.5mol/L Tris (ph8.8):36.3g Tris /200 ml UP 水
  • 10%APS:0.5 g APS / 5 ml UP 水，分装冻存

2. 缓冲液配置[edit]

  • 10X TBE (1L)
成分 质量
Tris 54 g
EDTA-Na₂ 3.72 g
硼酸 27.5 g
  • 调节 PH 至 8.3

3.上样液：蛋白缓冲液 = 4:1[edit]

4. 染色[edit]

  • 切取胶体放置于含 10 ml 考马斯亮蓝培养皿中， 37℃ 摇床振摇 3-4 h
  • 待颜色稳定后，吸出考马斯亮蓝溶液，可循环使用 2-3 次，用 UP 水反复清洗至基底原色

TME[edit]

Negative staining (uranyl acetate)[edit]

  • Grid activation: glow‑discharge copper grids for 30 s.
  • Sample staining
  1. apply 4.5 µL of sample onto the grid.
  2. Blot off the sample, add buffer to the grid, then blot off the buffer.
  3. Prepare parafilm and place three drops of uranyl acetate (pH adjusted) on the parafilm.
  4. Quickly transfer the grid into a staining droplet, blot off excess, and incubate for 30 s.
  5. Air‑dry the grid.
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