蛋白提取及WB

• 前处理-蛋白提取；
• 分离：SDS-PAGE
• 成像：转膜、WB

蛋白提取

1. 弃去贴壁细胞的培养基，1 mLPBS清洗，弃去，加入400 ulPBS，
2. 胰酶或者细胞刮板分离底部粘璧cell，移液枪转移至上述ep管中。流式不可采用刮板，会损伤cell；样品间刮板用PBS清洗；
3. 配制细胞裂解液：配制100 mM的PMSF in IPA，临用前1：100加入用商品化的细胞裂解液。
4. 按照12孔板每孔cell加入25 ul细胞裂解液的比例向ep管加入cell裂解液，4 ℃裂解10-30min、14k rpm离心15min。（6孔板每孔50ul裂解液）
5. 可取部分上清用于BCA测定
6. 用上清稀释loading buffer(按照商品化loading buffer 的要求），金属浴or沸水浴 5 - 10min，防止ep管加热过程开盖
7. 分装，-40--80℃保存，防止降解。

BCA测总蛋白

1. 试剂配制
   1. 试剂A：将10g BCA（二辛可宁酸）、20g Na₂CO₃H₂O、6g Na₂C₄H₄O₆2H₂O、4g NaOH和5g NaHCO3溶解于1 L蒸馏水中，NaOH或Na2CO3调节pH值至11.25。
   2. 试剂B：取2g CuSO₄ 5H₂O溶解于蒸馏水中，定容至50ml。
   3. BCA工作液：试剂A:试剂B=50:1混匀，可稳定一周。
   4. 标准蛋白质溶液:0.5mg/ml的BSA水溶液。
2. 实验操作
   1. PBS稀释组织样品5-10倍
   2. 校正标样（n=3）的制备：将0.5mg/ml的BSA水溶液分别取0、1、2、4、8、12、16、20 uL至96孔板中。加PBS补足至20 ul。（蛋白浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL）。浓度可按需调整，该方法LLOQ为0.01 mg/mL
   3. 20μl的样品溶液（n=3）加入到96孔酶标板中
   4. 每孔加入200μL BCA工作液，
   5. 37℃孵育20~30min
   6. 自然冷却至室温。
   7. 吸光度测定：在562nm下酶标仪比色测定，同时以空白孔作为参照。

SDS-PAGE

制胶

1. 支架下方垫橡胶垫实现密封，薄板朝外装载玻璃板，对准刻度（吸头辅助夹紧）

   

   SDS-PAGE制胶装置

2. 配制电泳液：每次用量约1.5 L

   1.5L SDS-PAGE电泳液组成
   Reagent	Quantity (for 1.5 L)
   Tris	4.545 g
   甘氨酸	21.6 g
   SDS	1.5 g
   UP水	1.5 L

3. 根据目标蛋白的分子量，按照商品化制胶试剂说明书调配试剂，制作分离胶和浓缩胶，倒入玻璃板，分离胶灌至距绿边1cm，浓缩胶灌满，插入梳子（刻度向外），注意观察梳齿气泡。

   

   SDS-PAGE凝胶比例

4. 凝固后，将玻璃板转移至电泳槽中，薄板向里，薄板上沿对齐标线，下沿不用触底，向夹层中倒入电泳液，验漏(是否夹紧，否则电泳时功率不稳)
5. 拔出梳子，用加样吸头吸取电泳液清洗样品孔，排气泡以及排除残余胶液
6. 上样及marker，一般1孔20ug，最多30ul，10孔梳10-15 ul/孔，15孔梳7-10 ul/孔；最侧边的孔及空余孔上样 1xloading buffer(电泳液稀释)
7. 电泳电压：浓缩胶约90V（W约为4W）,分离胶约150V（W约为8W），室温
8. 溴酚蓝迁移至凝胶2/3处即可停止电泳

   

   SDS-PAGE电泳例图

转膜

1. 转膜缓冲液的配制：

   1.5L 转膜缓冲液组成
   Reagent	Quantity (for 1.5 L)
   Tris	4.545 g
   甘氨酸	21.6 g
   UP水	1.2 L
   乙醇	300 mL*
   *：乙醇待水溶液体系完全溶解后再加入

2. PVDF膜及其支撑膜浸入乙醇中活化5 min；转入转膜缓冲液浸泡；可在膜右上角剪口分辨方向
3. 转膜缓冲液倒入盘中，各层预先在盘中浸透
4. 黑色在下，按照海绵（层数可增加，能夹紧即可）-1层滤纸-gel(切割周围)-膜-1层滤纸-海绵，进行叠加，注意覆盖转膜液排出气泡，夹紧，按照标识放入电泳槽
5. 4 ℃冰水浴，300 mAh，电泳约50 min

WB

WB实验

1. 剪裁目标蛋白和参比蛋白的膜，浸入封闭液中，摇床15min（按封闭剂的种类）
2. TBST配制：

   0.5L TBST缓冲液组成
   Reagent	Quantity (for 0.5 L)
   Tris	1.21 g
   NaCl	4 g
   UP水*	0.5 L
   吐温20**	2.5 mL（0.5%）
   *：Tris和NaCl溶解后HCl调整pH至7.6（pH计）
   **：调完pH再加吐温，使用用特殊的枪和吸头

3. 回收封闭液,TBST清洗5次(摇床5 min）
4. 加一抗5ml（用3%脱脂奶粉in TBST按照说明书稀释），膜浸透，避免漂浮或粘壁，37度摇床1h，4℃过夜
5. 回收一抗，膜用TBST清洗5次，每次摇床5min后弃去，去除残余一抗
6. 加入二抗（用3%脱脂奶粉稀释），37度摇床1h，TBST清洗5次，最后将膜保存在TBST中
7. 使用314的BioRad凝胶成像系统，image lab软件，将缓冲液中保存的膜浸泡至显影液（按说明书配制）中2min，转移至培养皿，放入样品盘，成像
8. 仪器：
   1. 开机：插排-稳压电源-仪器-电脑（关机反方向）
   2. image lab软件:运行软件-确定-select scanner-chom...-select-chem Hi sentilye(取消VVA勾选）

      

      WB结果例图

      备注

      1. 实验操作：
         1. 制胶前用70%乙醇清洁并擦拭玻璃板，提前洗净烘干。
         2. 内参一般不和样品同一块膜，单染方便抗体回收，只回收一抗，不回收二抗。一抗多为兔种属，二抗是抗兔的山羊抗，二抗基本只针对一抗的种属。抗体一般-20℃保存。
         3. 对于悬浮cell或者出现悬浮现象的贴壁细胞，直接移液枪转移12孔板中cell培养液到ep管中，底部留存部分液态培养基用于刮板转移，离心2k rpm 3min，弃去上清，PBS重悬，n合1，再次离心，弃上清，清洗cell，重悬。加入细胞裂解液。
         4. 制好的胶尽快使用，若需隔夜可将凝胶置于电泳缓冲液中过夜
         5. 上层溶液左中右位点均匀加入
         6. 该测定实验本身影响因素较多，所以n个重复合成一个样本进行SDS-PAGE，一组样本尽量一块凝胶进行分析。
         7. 预实验可省略bca，根据细胞密度简单确定上样体积，使用内参(cell固定表达蛋白，且相对量较为固定）进行相对定量。常用内参：
            1. GAPDH，参与糖酵解的酶，37 kD
            2. β-Actin，广泛分布于各种组织中的肌动蛋白，42 kD
            3. 实验室配制loading buffer：
            4. 实验室配制试剂：

      Loading buffer上样缓冲液
      Reagent	Quantity
      Tris	3.8 g
      10%SDS	10 mL
      甘油	10 mL
      溴酚蓝	0.05 g
      UP水	100 mL
      巯基乙醇	临用前加入，巯基乙醇：与前述溶液按照=1：3混合

      
      

      分离胶
      Reagent	Quantity（5mL/板）
      H₂O	1 mL
      30%Arc - Bis	2 mL
      1 M Tris（pH 8.8）	1.9 mL
      10% SDS	0.05 mL
      10%过硫酸铵（APS）	0.05 mL
      TEMED	2 uL

      
      

      浓缩胶
      Reagent	Quantity（5mL/板）
      H₂O	2.1 mL
      30%Arc - Bis	0.5 mL
      1 M Tris（pH 6.8）	0.38 mL
      10% SDS	0.03 mL
      10%过硫酸铵（APS）	0.03 mL
      TEMED	3 uL

      • 实验室制胶方法：先配制并灌注分离胶至绿边下缘1cm，均匀加UP水液封，静置1h直至分界线明显，配制浓缩胶，倒掉液封水，并用滤纸吸干，灌注浓缩胶，插入梳子，静置1h，拔下梳子并加缓冲液排气泡，静置30 min后再上样
      1. 其他：
         1. 该实验用于药效评估，药效前应当先做毒性实验
         2. 细胞裂解液的成分：pmsf
         3. 封闭液的组成：BSA或5%脱脂奶粉溶液
         4. 实验室制胶：

      原理

      1. SDS-PAGE原理
         阴离子与蛋白质按比例（摩尔比）结合带上负电荷（SDS数量远超蛋白本身电荷数），消除蛋白质原有的电荷差异。SDS破坏蛋白质的氢键、疏水作用力等非共价键，破坏高级结构，解离为蛋白质亚基，蛋白质解聚为单体。（m/z决定电泳结果，即只与蛋白质分子量有关，而与电荷和分子形态无关）。为了确保蛋白质在电泳过程中处于变性展开状态，并且始终带有负电荷，在凝胶蛋白质样品和凝胶缓冲液中，都需要添加SDS。
      2. SDS-PAGE Loading buffer
         主要含有SDS、甘油、β-巯基乙醇（β-ME）、带负电荷的染料(常用溴酚蓝)，甘油可以使蛋白样品密度大于电泳缓冲液而沉入梳底。Β-巯基乙醇可以打开二硫键。而带有负电荷的染料，其分子量小于绝大多数的分子样品。迁移速率最快。样品制备好以后，上样之前需要将其加热5分钟，而使其变性展开。
      3. 浓缩胶和分离胶 丙烯酰胺(Arc)和甲叉双丙烯酰胺(Bis，作为聚丙烯酰胺的linker，形成孔洞结构)在催化剂(过硫酸铵，形成自由基)和加速剂（TEMD，二（N-二甲基）乙二胺，加速催化剂形成自由基）的作用下，形成的一种三维网状结构，允许蛋白质通过。可以通过改变丙烯酰胺的浓度来改变孔径的大小。高浓度凝胶孔径小，利于分离小分子蛋白；低浓度的凝胶孔径大，利于分离大分子蛋白。
         1. 电泳缓冲液：pH 8.3，含有SDS、Cl^-和甘氨酸（pI 5.97）。
         2. 上层浓缩胶：pH 6.8，孔径大，样品先进入浓缩胶，形成很窄的条带。因为甘氨酸显示电中性，与负电的Cl^-挤压蛋白质，使得条带变窄
         3. 下层分离胶：pH 8.8，孔径小，通过分子筛分离蛋白质。
      4. 成像原理
         增强化学发光法（ECL）：显影剂含有H₂O₂和鲁米诺（或其衍生物），二抗上的HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光。稳定性好，灵敏度高，成像性好，对仪器设备无特殊要求，是目前最常用的显影方法。
      5. 细胞裂解液
         主要是表面活性剂，破坏生物膜。RIPA含有SDS，脱氧胆酸钠，TritonX-100的混合溶液。

         蛋白定位	裂解液种类
         全细胞	NP - 40 或 RIPA
         细胞质（可溶性蛋白）	Tris - HCL
         细胞质（细胞骨架等不溶性蛋白）	Tris - Triton
         细胞膜	NP - 40 或 RIPA
         细胞核	RIPA
         线粒体	RIPA

      6. BCA测蛋白原理： 在碱性环境下，蛋白质能促使试剂中的铜离子（Cu2+）还原为单价铜离子（Cu+）。Cu+离子与BCA发生螯合反应，生成一种稳定的水溶性的蓝紫色的络合物，562纳米波长处具有强烈的吸光性。借助标准曲线定量。
      7. 转膜原理 电转印是蛋白免疫印迹中最常见的转印方法，即使用电场力驱动蛋白从凝胶中洗脱转移到膜上。聚偏二氟乙烯（PVDF）。具有很强的蛋白结合能力，大多数免疫印迹实验，可使用孔径为0.45 μm的膜，0.2 μm孔径的膜适合转印低分子量蛋白 (<15,000 kD)，低分子蛋白有可能穿过较大孔径的印迹膜。转膜时，凝胶中的样品由负极移向正极，到达膜的表面，与蛋白稳定结合，方便后续进行抗体孵育。