常用细胞房操作

更换培养基

1. 更换频率1次/d。
2. 弃去旧培养基：
   1. 贴壁细胞（如癌细胞）：移液枪直接吸取培养基并弃去；
   2. 悬浮细胞：收集原培养基及cell置于EP管中，离心，弃上清：
   3. 半贴壁细胞：采用半换液，倾斜孔板或培养皿，移液枪吸取上层培养基弃去。
3. 无需PBS清洗,直接加入新鲜培养基。培养基中的酚红用于判断培养基有无过期。培养基总量：10cm 培养皿6-10m。

表1：贴壁细胞或悬浮细胞接种数量、培养基体积

培养器皿	每孔表面积 (cm²)	每孔培养基的 体积（ml）	贴壁细胞转染前一天 接种密度	悬浮细胞转染当 天接种密度
96孔板	0.3	0.1	5000±2500	2-5×105
24孔板	2	0.5	25000±10000	1-2.5×105
12孔板	4	1	50000±20000	2-5×105
6孔板	10	2	150000±50000	0.4-1×106
60mm培养皿	20	4	400000±100000	1-2.5×106
100mm培养皿	60	10	1×106±250000	2-5×106
*：乙醇待水溶液体系完全溶解后再加入		*：贴壁细胞培养密度取决于培养器皿的表面积而悬浮细胞则由培养基的体积决定。

12孔板CELL铺板（给药用）

1. 细胞类型：肿瘤细胞(人源)（贴壁cell）
2. 操作
   1. 取培养皿，弃去培养基，加入2ml PBS清洗，弃去
   2. 加入2 mL胰酶，37 ℃消化2 min。
   3. 加含血清培养基2 mL（终止胰酶消化），转移至EP管中，离心，弃去上清，
   4. 加入培养基重悬，先向12孔板中每一孔加入0.5 mL含血清培养基，再添加0.5 mL cell重悬液（培养基）。先铺1孔，显微镜观察密度，根据需求调整重悬液或稀释液的体积。轻微晃匀，注明cell、操作、日期。
   5. 37℃孵育过夜。过夜后，细胞密度达到70-80%时给药。
3. 备注：
   1. 铺板前可以先在试管中混匀cell再铺板，更均匀。
   2. 贴壁cell可通过增加培养基用量，给与更多营养物质，促进cell生长。但是培养基不能太多，会影响气体交换。可以12孔板 1ml变为1.5ml。
   3. 胰酶消解时间取决于cell种类。过度消化会导致细胞膜蛋白损伤，影响细胞膜完整性和细胞贴壁；过度消化可能会使细胞聚集成团，需后续操作吹散，否则会影响细胞状态；过度消化会影响细胞表面受体的功能和完整性，从而影响细胞正常信号传导和功能表达。
   4. 一般一皿长满的肿瘤细胞可铺3块板(6 12 24孔板)，但是96孔板周围一圈的只添加PBS，仅在中心的60个孔铺细胞，60孔共铺约1/10 or 1/12 or 1/15皿细胞。因为本次实验的人源细胞生长比较慢，所以一皿cell铺2.5块板
   5. 贴壁cell给药前一晚需进行12孔板铺板，过夜，目的是为了让cell贴壁生长。
   6. 无血清培养基-cell处于饥饿状态-自噬加强

转染及细胞给药

1. 转染复合物的制备
   1. 由于转染试剂易被微生物及酶降解。所以转染操作需在cell房使用无菌无酶吸头进行操作。根据转染试剂的说明书，筛选DNA和转染试剂的比例
   2. 转染产物进行琼脂糖凝胶电泳，成功转染的产物为带正电，无琼脂糖凝胶电泳移动行为。
   3. 根据琼脂糖凝胶电泳结果，确认DNA和转染试剂的最佳比例。
2. 转染细胞
   1. 在前一天完成细胞铺板，第二天显微镜确认细胞密度达到70~80%
   2. 更换培养基为新鲜培养基以及给与目标浓度的转染复合物，可预先将药物直接与培养基混匀，一次性添加（n>=2）。
3. 备注：
   1. 12孔板每孔中Mate转染试剂的净含量不要超过4uL，避免细胞毒性。
   2. 试剂加至底部，避免附壁。
   3. 无特殊情况，不额外考察耗材对DNA的吸附。
   4. 该转染试剂使用酚红作为稀释剂，目的是便于后续直接转染cell。

细胞传代

1. 细胞：人源肿瘤cell（生长慢，1/3皿传代）和鼠源肿瘤细胞（生长快，1/10皿传代），
2. 试剂：胰酶、PBS、含血清的高糖DMEM培养基
3. 传代
   1. 取出培养皿，弃旧培养基，加入2mL PBS，加盖摇晃，弃去PBS，重复2次清洗去除旧培养基和代谢杂质。
   2. 加入2mL胰酶，37度消化2 min，加入2 ml含有血清培养基中断消化。
   3. 转移到ep管，离心，弃去上清。1mL培养基重悬cell
   4. 加入7mL培养基于皿中，向皿中加入cell重悬液。
4. 备注：
   1. 传代：生长较慢的cell 1皿可传2皿（1/2）or 1皿（1/1），一般是1皿传3皿（1/3）
   2. 培养皿为一次性使用

细胞保种

• 目的：长期保存细胞

1. 提前将冻存液预冷至4°C，冰箱放置至少30分钟。
2. PBS清洗后离心后去上清
3. 加入4℃冻存液重悬
4. 转移1mL至保种管中。液氮或-80℃迅速冻存（DMSO在常温下对细胞有较大的毒性）。冻存管标注cell 操作人 日期
5. 备注：
   1. 冻存液(商品化)：1640培养基-血清-DMSO=7:2:1，细胞冻存液通常包含渗透性和非渗透性保护剂。DMSO是一种能够渗透到细胞内的冷冻保护剂，降低细胞内外的电解质浓度，防止细胞内水分外渗，从而减少冰晶的形成。4℃时，其毒性会大大减弱，而且渗透速度也会加快。因此，最简单的方法是将冻存液一直放在4°C冰箱中，随用随取，用完再放回冰箱。
   2. 冻存细胞的选择：处于对数生长期且细胞密度在80%-90%左右的细胞，以确保细胞在最佳状态。细胞密度过低可能会影响存活率。冻存时的细胞密度推荐为3×10⁶到1×10⁷细胞/mL。或者采用1/2皿人源肿瘤细胞/管，1/2皿鼠源肿瘤细胞/管。
   3. 保种的cell没有明确保质期，复苏后一天观察细胞密度，调整培养基用量即可。

细胞复苏

1. 提前开启37℃水浴锅
2. 取出冻存细胞置于一次性手套，37℃水浴锅解冻1 min
3. 加入1ml培养基，吹匀
4. 将细胞移入15 mL离心管中，加3ml培养基
5. 离心(1000rpm 5min)
6. 丢弃上清液，吸1ml培养基到离心管中吹匀，转移到含有培养基的培养皿中，并标记:细胞，日期、操作人
7. 转移到培养箱中

蛋白组学送样前处理

1. PBS清洗给药后的cell，离心，弃去上清
2. 液氮迅速冷冻，防止酶降解。打开液氮罐，提出冻存架并倾倒液氮，放入冻存管，放回即可

原理

1. 胰酶
   1. 胰酶的作用原理： 胰酶是一种具有底物特异性的蛋白水解酶。贴壁细胞通常通过一组蛋白质（整合素）黏附在培养容器表面或胞外基质上，胰酶可分解这些蛋白质。加入胰酶后，细胞从扁平的贴壁状态慢慢转变成游离的球形状态，这是因为细胞失去附着力，趋向于选择最小能量配置，即球形。一般情况下，会在胰酶中添加EDTA螯合剂，用于辅助破坏细胞之间的钙依赖连接。
   2. 血清失活胰酶 血清中含有一些能够中和或抑制胰酶活性的因子。如：
      1. 酶抑制蛋白：可以结合胰酶，抑制胰酶活性，有效终止胰酶对细胞的消化作用。
      2. 钙、镁离子：帮助稳定细胞膜和细胞间的连接，修复胰酶导致的细胞粘附力下降。
      3. 营养物质和生长因子：可修复受损的细胞膜，有助于维持细胞的正常生理状态，保障分离过程中的细胞活性和完整性。
2. 转染试剂
   1. 阳离子聚合物转染试剂：带负电的核酸与带正电的阳离子聚合物转染试剂（上面的Mate试剂）形成带正电的复合物，与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，并通过内吞作用进入细胞。特点：水溶性好；细胞毒性很低，很稳定；对血清的耐受性较强。如聚乙烯亚胺（PEI）。
   2. 阳离子脂质体转染试剂：阳离子脂质体的基本结构由带正电荷的头基和一个或两个烃链组成，带正电荷的头基与带负电荷的核酸通过静电作用形成复合物lipoplex，经细胞的内吞作用进入细胞。特点：没有免疫原性；脂质体本身会参与细胞生理活动，引起基因表达的上调或下调，脂质体这些作用是造成细胞毒性的根本原因；在血清存在的情况下会迅速失活（当血清浓度过高时，可能会与转染试剂发生相互作用，形成复合物，从而降低转染试剂与细胞的结合能力，导致转染效率下）；在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性。
3. 细胞密度
   1. 密度特性

      

      细胞密度示意图

      20-30%：对于多数细胞可以生长，若细胞量太少可能会死亡。
      30-40%：一般不做任何处理。
      40-50%：如果使用毒性较低的转染试剂，可进行小干扰转染，6-8 h后换液。
      60-70%：如果使用毒性低的转染试剂，可进行小干扰转染，需要过夜转染。
      80-90%：如果使用毒性较大的转染试剂或质粒转染可以用这个密度，也用于细胞传代、给药。
      100%：必须传代的密度；也可以用于毒性大的药物造模。
      

   2. 实验选择
      1. 实验通常会选择处于指数生长期，代谢活性较高的细胞进行。其具有较高的代谢活性，能够更快地进行增殖，提供更多的细胞用于实验：细胞数量充足，生理状态较为稳定，能够更好地反映实验条件下的变化，可以确保实验结果的有效性和可重复性。
      2. 不同的细胞指数生长期细胞密度不同。
      3. 过高的细胞密度可能会导致细胞间的相互干扰，影响实验结果的准确性。
   3. 常用培养基
      1. DMEM高糖培养基
         DULBECCO'S MODIFIED EAGLE MEDIUM，杜氏改良EAGLE培养基-高葡萄糖,DMEM培养基最初设计葡萄糖含量为1000 mg/L（低糖型），后来又发展出葡萄糖含量为4500 mg/L（高糖型），现已广泛应用于各种细胞的培养。DMEM高糖型培养基普遍应用于生长快、粘附性低的细胞、杂交瘤的骨髓瘤细胞、克隆细胞、DNA转染的转化细胞、各种原代病毒宿主细胞、单一细胞的培养以及疫苗的生产。主要成分：

         试剂	浓度	作用
         HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）	no	两性离子缓冲液，在37℃下的pKa为7.3，缓冲能力强。缓冲能力与CO2浓度无关，当细胞培养需要在CO2之外进行长时间操作时，提供额外的缓冲能力。HEPES可以以10mM至25mM的最终浓度添加到细胞培养基
         丙酮酸钠	1 mM	在葡萄糖不足时，可以作为替代碳源，支持细胞代谢
         酚红	15 mg/L	pH指示剂，当培养基酸化时，其颜色会从红色变为黄色，提供直观的pH变化参考
         NaHCO₃	3700 mg/L	在CO₂培养箱中与培养基中的二氧化碳反应，维持pH值在7.2-7.4之间，确保细胞在适宜的酸碱环境中顺利生长
         L-谷氨酰胺	4 mM	必须氨基酸，作为蛋白质和核苷酸合成的重要前体，谷氨酰胺还参与细胞代谢中的氮循环
         D-葡萄糖	4500 mg/L	能量来源
         L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸等	/	多种必需氨基酸
         维生素、矿物质	/	维持渗透压

      2. RPMI 1640培养基
         最初是为淋巴细胞培养专门设计的，现被发现适用于多种哺乳动物细胞，包括 HeLa 细胞、Jurkat 细胞、 MCF-7 细胞、PC12 细胞、PBMC 细胞、星形胶质细胞和癌细胞等。广泛应用于多种哺乳动物细胞的体外培养。
         不含蛋白、脂质或任何生长因子。因此，RPMI 1640 使用时需要搭配血清或无血清添加物，通常添加10%的胎牛血清(FBS)。

         试剂	作用
         糖类	如葡萄糖，为细胞提供能量和碳源
         氨基酸	是蛋白质合成的基本组成部分
         维生素	如维生素B群、维生素C等，参与细胞代谢过程
         矿物质	包括钠、钾、钙、镁等，维持细胞内外的离子平衡
         胺基酸	如谷胱甘肽、谷氨酰胺等，具有抗氧化和细胞保护作用
         碳酸氢钠	需要5-10% CO2环境来维持生理pH值
         生长因子	一些RPMI 1640培养基可能含有生长因子，如胰岛素、转铁蛋白等，提供额外的生长支持