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| <div style="color: black !important; font-family: 'Times New Roman', SimSun, serif !important;">
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| == 操作 ==
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| #取组织：
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| ##断颈处死小鼠，整体浸入含酒精的烧杯中灭菌3-5min；
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| ##沿着腹部中线剪开取出脾脏，放入含PBS的6孔板中，转移至细胞房。
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| #研磨：
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| ## 换用新的6孔板或50ml EP管（用于容纳筛网0.45μm）
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| ## 加3mL的2%FBS-PBS，放入筛网和脾脏，用针筒芯研磨至无明显固体，转入灭菌EP管，离心2k rpm 3-5min，弃上清
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| ## 加入5 mL红细胞裂解液，吹打混匀，冰上裂解5min
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| ## 离心2krpm 3-5min，弃上清，加入2%FBS-PBS重悬。若仍有红色cell沉积可重复裂解
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| #分选：
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| ## 取20μL细胞悬液计数（单位：cell/mL）
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| ## 按分选试剂盒要求比例加入分选试剂，分离目标细胞
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| ## 分选和未分选cell CD8抗体染色，流式，获得分选效率
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| #传代荧光及铺板（6孔板）：
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| ## 取20μL细胞悬液计数
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| ## 离心弃上清，用CFSE溶液（荧光染料）重悬细胞，静置2min
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| ## 加入PBS终止染色，离心去上清
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| ## 按1-2×10⁶ cell/孔（6孔板）加入含抗体（刺激T cell增长）培养基
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| ## 显微镜确认细胞状态
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| #培养：
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| ##37℃培养，显微镜观察。每24h观察一次cell状态，成功传代后应观察到成簇细胞。
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| #细胞流式
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| ##分选前后取细胞悬液加CD8+抗体，用于流式测定T cell占比（评估分选效率）
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| ##CFSE染色前后取细胞悬液，用于流式测定CFSE信号（作传代对照）
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| ##传代72h后，流式，观察传代结果，传代结果例图：<br/>
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| [[File:CFSE荧光强度随细胞分裂递减.jpg|center|thumb|300px|CFSE荧光强度随细胞分裂递减]]
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| == 备注 ==
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| # 操作全程细胞在2% FBS-PBS冰上保存，低温降低代谢
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| == 原理 ==
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| === 1. CD8+T细胞分选试剂盒 ===
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| 小鼠CD8+T细胞分选试剂盒（阴选）：通过阴性分选法从小淋巴结、脾脏及其混合样本中分离、纯化CD8+T细胞。其原理是选用生物素(biotin)标记单克隆抗体Cocktail对非目标细胞(非CD8+T细胞)进行标记，而后通过链霉亲和素(streptavidin)标记的磁珠对非目标细胞进行清除,从而得到无磁珠标记的小鼠CD8+T细胞。
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| 试剂盒说明书：<br/>
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| [[File:CD8+T细胞分选试剂盒说明书.jpg|center|thumb|CD8+T细胞分选试剂盒示意图]]
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| === 2. CFSE荧光染料 ===
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| 荧光染料CFSE or CFDA SE，5，6- carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester，即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，这使得 CFSE 成为一种良好的细胞标记物。当CFSE以含有两个乙酸基团和一个succinimidyl ester功能基团的形式存在时，不具有荧光性质，而具有细胞膜通透性，能够自由进入细胞；而当其扩散进入细胞内环境，内源的酯酶可将其乙酸基团水解，此种形式的CFSE分子具有很高的荧光活性，被激发能够产生绿色荧光，却不再具有膜通透性；同时，其含有的succinimidyl ester基团能与胞内的细胞骨架蛋白中的游离胺基反应，最终形成具有荧光的蛋白加合物。因此，当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。这种现象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。
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| === 3. 红细胞裂解液 ===
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| 它既不损伤有核细胞又能充分的去除红细胞。比较温和，主要用于经酶消化分散的组织细胞的分离纯化，淋巴细胞的分离纯化以及组织细胞蛋白与核酸提取等实验中红细胞的去除。利用细胞内外的离子浓度差异，形成渗透压差，外部的水分会扩散至细胞内，使红细胞膨胀，达到裂解的效果。
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| 红细胞裂解液组成：
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| {| class="wikitable"
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| ! colspan="3" | ACK lysis buffer
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| ! Reagent
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| ! Quantity (for 1000 mL)
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| ! Final concentration
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| | NH<sub>4</sub>Cl
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| | 8.02 g
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| | 150 mM
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| | KHCO<sub>3</sub>
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| | 1 g
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| | 10 mM
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| |-
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| | Na<sub>2</sub>EDTA
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| | 37.2 mg
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| | 0.1 mM
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| |-
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| | colspan="3" | Dissolve all reagents in 850 mL of H<sub>2</sub>O. Adjust the pH to 7.2–7.4, and add H<sub>2</sub>O to 1000 mL. Store for up to 6 mo at room temperature.
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| |}
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| === 4. 胎牛血清(FBS)作用 ===
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| 临时培养基：是细胞培养环节中常用的营养补充剂。含有大量的细胞生长因子、生长激素、蛋白质别的养分的混合物质，这都是细胞生长和生存所必须的。①胎牛血清是细胞的重要营养来源；②胎牛血清帮助细胞附着和扩散（许多细胞需要附着在基质上才能生长和分裂。胎牛血清含有纤维连接蛋白和层粘连蛋白等蛋白质，通过与细胞表面受体相互作用促进细胞附着和扩散。这些蛋白质为细胞粘附创造了有利的环境，并为细胞生长和扩张提供了锚定点。）③胎牛血清可以起缓冲和pH调节作用；④胎牛血清从多方面维持细胞健康（胎牛血清含有延缓细胞凋亡、有助于细胞存活的因子。这些生物活性物质，可以在一定程度上，减少细胞培养过程中，细胞死亡事件的发生，并为维持细胞活力提供有利帮助。）
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