Protocol

Protein(RuCHMO/GDH) Conjugation to DNA Origami

Methods

Conjugation

• Proteins containing 6x Histidine at the C terminus reacted, with the chemical DBCO-PEG4-Bis-sulfone(DPBS) for 4 h at room temperature. The bis-sulfone group reacts with the Histidines at the C terminus of the protein, and then an azide modified oligonucleotide is conjugated to the protein by click chemistry between the azide- and the DBCO-group.

Incubation

• conjugation: DNA Origami = 20:1, and incubate in a PCR machine with a temperature ramp starting from 1 h at 37 ℃ follow by 14 h at 22 ℃, and immediately after incubation the nanopatterns are stored at 4 ℃.

Oligonucleotide Sequence

• sequence(RuCHMO):CTCTCCTTCTTCCCTTTCTTT
• Sequence(GDH):TTCGACAGCATGAACATCAGC

Protein

• RuCHMO: 65.45 KDa
• GDH: 35 KDa

Purification

• 30 kDa MWCO 0.5 ml Amicon centrifugal filters (Milli-pore)

electro-phoresis

Sample

Reagent	Sequence
DBCO-PEG4-Bis-sulfone
azide modified oligonucleotide	CTCTCCTTCTTCCCTTTCTTT
azide modified oligonucleotide	TTCGACAGCATGAACATCAGC

Protocol (版本 1.0)

一、酶-核酸杂交体的制备

• GDH-Oligo

1. GDH 制备

取 1.4 mg GDH 溶解于 2 mL 1×PBS 中。

2. 稀释 GDH（样品液）

样品	原样品浓度	终样品浓度	加入量	总体积
GDH	0.7 mg/mL	0.175 mg/mL	25 μL	100 μL

3. 溶解 DBCO-PEG4-Bis-Sulfone 于 DMF(N,N-二甲基甲酰胺) 中（100 mM）

取 DBCO 2 mg 溶解DMF 20 ul 中

4. 稀释 DBCO（样品液）

样品	原样品浓度	终样品浓度	加入量	总体积
DBCO	100 mM	20 mM	2 μL	20 μL

5. 向 GDH 样品液中加入 DBCO，并在室温下孵育 4 h

样品	最终浓度	分子量	总摩尔量	Eq DBCO	DBCO 摩尔量	DBCO 加入量	总体积
GDH	5 μM	35 kDa	0.5 nMol	20 Eq	10 nMol	1 μL	100 μL

6. 使用 10 kDa 超滤管超滤去除游离 DBCO

7. Oligo

Name	序列	bp	修饰	Nmol/管	buffer (μL)	浓度 (mM)
S1	CTCTCCTTCTTCCCTTTCTTT	21	5'Azide	123.53	123.53	1
S2	TTCGACAGCATGAACATCAGC	21	5'Azide	97.51	97.51	1

7. 加入 Oligo，并在 37 ℃ 下孵育 4 h

样品	总摩尔量	Eq Oligo	Oligo 摩尔量	S1 加入量	总体积
GDH	0.5 nMol	20 Eq	10 nMol	10 μL	100 μL

• RuCHMO-Oligo

1. RuCHMO 制备

样品	初始浓度	取样量	最终浓度	最终体积
RuCHMO	28.2 μM	100 μL	5 μM	564 μl

• 最终样品 分为 4份 每份 140 ul

2. 向 100 ul RuCHMO 样品液中加入 DBCO，4℃冰箱中冰浴孵育 4 h

样品	最终浓度	分子量	总摩尔量	Eq DBCO	DBCO 摩尔量	DBCO 加入量	总体积
RuCHMO	5 μM	65.45 kDa	0.5 nMol	20 Eq	10 nMol	1 μL	100 μL

3. 4 ℃, 12000 转, 超滤 20 min

4. 加入 Oligo，并在 4 ℃冰箱 冰浴下孵育 过夜

样品	总摩尔量	Eq Oligo	Oligo 摩尔量	S1 加入量	总体积
RuCHMO	0.5 nMol	20 Eq	10 nMol	10 μL	100 μL

二、Nativepage

Reference

1. 制胶

成分	体积/质量
30% ACR: Bis(29:1)	4.8 ml
Tris 1.5M	2 ml
10% APS	80 ul
TEMED	8 ul
总	8 ml

注： 浓度(ACr)计算公式为 (30% × 4.8) / 8

• 1.5mol/L Tris (ph8.8):36.3g Tris /200 ml UP 水
• 10%APS:0.5 g APS / 5 ml UP 水，分装冻存

2. 缓冲液配置

• 10X TBE (1L)

成分	质量
Tris	54 g
EDTA-Na₂	3.72 g
硼酸	27.5 g

• 调节 PH 至 8.3

3.上样液：蛋白缓冲液 = 4:1

4. 染色

• 切取胶体放置于含 10 ml 考马斯亮蓝培养皿中， 37℃ 摇床振摇 3-4 h
• 待颜色稳定后，吸出考马斯亮蓝溶液，可循环使用 2-3 次，用 UP 水反复清洗至基底原色