Protein extraction: Difference between revisions
No edit summary |
|||
| Line 3: | Line 3: | ||
*'''配液：细胞裂解液=PIRP:PMSF=100:1, Loading buffer 蛋白上样缓冲液(5×), β-巯基乙醇(保护巯基)''' | *'''配液：细胞裂解液=PIRP:PMSF=100:1, Loading buffer 蛋白上样缓冲液(5×), β-巯基乙醇(保护巯基)''' | ||
*'''提取：1.六孔板PBS清洗，消化，离心，移至1.5ml离心管内，PBS洗一次 2.放置于冰盒上，每孔加裂解液50-60 ul，吹打均匀，4℃裂解30 min 3. 4℃，12000-14000 rpm,15 min离心 4. 取上清液于0.5 ml离心管内，每次吸取10 ul定量 5.取1-2 ul用作BCA检测，剩余按上清液：Loading buffer=4:1 | *'''提取：1.六孔板PBS清洗，消化，离心，移至1.5ml离心管内，PBS洗一次 2.放置于冰盒上，每孔加裂解液50-60 ul，吹打均匀，4℃裂解30 min 3. 4℃，12000-14000 rpm,15 min离心 4. 取上清液于0.5 ml离心管内，每次吸取10 ul定量 5.取1-2 ul用作BCA检测，剩余按上清液：Loading buffer=4:1 | ||
== 组织蛋白提取 = | == 组织蛋白提取 == | ||
*'''提取：把组织剪成细小碎片，复溶细胞裂解液，按每20 mg组织加入100-200 ul裂解液，用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解，4℃ 10000-14000离心10-15 min，取上清液，取样进行BCA检测，剩余4：1与蛋白上样缓冲液混匀，煮沸5-10 min，分装-80℃保存(45 ul/管，一次用20 ul上样，每孔一般30-40 ug，上样体积10-15 ul) | *'''提取：把组织剪成细小碎片，复溶细胞裂解液，按每20 mg组织加入100-200 ul裂解液，用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解，4℃ 10000-14000离心10-15 min，取上清液，取样进行BCA检测，剩余4：1与蛋白上样缓冲液混匀，煮沸5-10 min，分装-80℃保存(45 ul/管，一次用20 ul上样，每孔一般30-40 ug，上样体积10-15 ul) | ||
Latest revision as of 06:31, 7 October 2025
细胞总蛋白提取[edit]
- 配液：细胞裂解液=PIRP:PMSF=100:1, Loading buffer 蛋白上样缓冲液(5×), β-巯基乙醇(保护巯基)
- 提取：1.六孔板PBS清洗，消化，离心，移至1.5ml离心管内，PBS洗一次 2.放置于冰盒上，每孔加裂解液50-60 ul，吹打均匀，4℃裂解30 min 3. 4℃，12000-14000 rpm,15 min离心 4. 取上清液于0.5 ml离心管内，每次吸取10 ul定量 5.取1-2 ul用作BCA检测，剩余按上清液：Loading buffer=4:1
组织蛋白提取[edit]
- 提取：把组织剪成细小碎片，复溶细胞裂解液，按每20 mg组织加入100-200 ul裂解液，用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解，4℃ 10000-14000离心10-15 min，取上清液，取样进行BCA检测，剩余4：1与蛋白上样缓冲液混匀，煮沸5-10 min，分装-80℃保存(45 ul/管，一次用20 ul上样，每孔一般30-40 ug，上样体积10-15 ul)