Editing Protocol

<div style="color: black !important; font-family: 'Times New Roman', SimSun, serif !important, line-height:1.5;">
== Protein(RuCHMO/GDH) Conjugation to DNA Origami ==
=== Methods ===
=== Conjugation ===
*''' Proteins containing 6x Histidine at the C terminus reacted, with the chemical DBCO-PEG4-Bis-sulfone(DPBS) for 4 h at room temperature. The bis-sulfone group reacts with the Histidines at the C terminus of the protein, and then an azide modified oligonucleotide is conjugated to the protein by click chemistry between the azide- and the DBCO-group.'''

=== Incubation ===
*'''conjugation: DNA Origami = 20:1, and incubate in a PCR machine with a temperature ramp starting from 1 h at 37 ℃ follow by 14 h at 22 ℃, and immediately after incubation the nanopatterns are stored at 4 ℃.'''
=== Oligonucleotide Sequence ===
*'''sequence(RuCHMO):CTCTCCTTCTTCCCTTTCTTT'''
*'''Sequence(GDH):TTCGACAGCATGAACATCAGC'''
=== Protein ===
*'''RuCHMO: 65.45 KDa'''
*'''GDH: 35 KDa'''

=== Purification ===
*''' 30 kDa MWCO 0.5 ml Amicon centrifugal filters (Milli-pore)'''
=== electro-phoresis ===
{| class="wikitable"
|+ Sample
|-
! Reagent
! Sequence
|-
| DBCO-PEG4-Bis-sulfone
| 
|-
| azide modified oligonucleotide
| CTCTCCTTCTTCCCTTTCTTT
|-
| azide modified oligonucleotide
| TTCGACAGCATGAACATCAGC
|}
<div style="color: black !important; font-family: 'Times New Roman', SimSun, serif !important, line-height:1.5;">

== Protocol (版本 1.0) ==
===<big>''' 一、酶-核酸杂交体的制备 '''</big>===
* '''<big><span style="color:red;">GDH-Oligo</span></big>
<div style="color: black !important; font-family: 'Times New Roman', SimSun, serif !important, line-height:1.5;">

=== 1. GDH 制备 ===
取 '''1.4 mg GDH''' 溶解于 '''2 mL 1×PBS''' 中。

=== 2. 稀释 GDH（样品液） ===
{| class="wikitable" style="text-align:center; width:80%"
! 样品 !! 原样品浓度 !! 终样品浓度 !! 加入量 !! 总体积
|-
|'''<span style="color:red;"> GDH </span>'''|| 0.7 mg/mL || 0.175 mg/mL || 25 μL || 100 μL
|}

=== 3. 溶解 DBCO-PEG4-Bis-Sulfone 于 DMF(N,N-二甲基甲酰胺) 中（100 mM） ===
取'''  DBCO 2 mg''' 溶解'''DMF 20 ul''' 中

=== 4. 稀释 DBCO（样品液） ===
{| class="wikitable" style="text-align:center; width:80%"
! 样品 !! 原样品浓度 !! 终样品浓度 !! 加入量 !! 总体积
|-
| DBCO || 100 mM || 20 mM || 2 μL || 20 μL
|}

=== 5. 向 GDH 样品液中加入 DBCO，并在室温下孵育 4 h ===
{| class="wikitable" style="text-align:center; width:90%"
! 样品 !! 最终浓度 !! 分子量 !! 总摩尔量 !! Eq DBCO !! DBCO 摩尔量 !! DBCO 加入量 !! 总体积
|-
| GDH || 5 μM || 35 kDa || 0.5 nMol || 20 Eq || 10 nMol || 1 μL || 100 μL
|}

=== 6. 使用 10 kDa 超滤管超滤去除游离 DBCO ===
=== 7. Oligo ===
{| class="wikitable" style="text-align:center; width:80%"
! Name !! 序列 !! bp !! 修饰 !! Nmol/管 !! buffer (μL) !! 浓度 (mM)
|-
| S1 ||CTCTCCTTCTTCCCTTTCTTT|| 21 || 5'Azide || 123.53 || 123.53 || 1
|-
| S2 ||TTCGACAGCATGAACATCAGC|| 21 || 5'Azide || 97.51 || 97.51 || 1
|}

=== 7. 加入 Oligo，并在 37 ℃ 下孵育 4 h ===
{| class="wikitable" style="text-align:center; width:90%"
! 样品 !! 总摩尔量 !! Eq Oligo !! Oligo 摩尔量 !! S1 加入量 !! 总体积
|-
| GDH || 0.5 nMol || 20 Eq || 10 nMol || 10 μL || 100 μL
|}

*'''<big><span style="color:red;"> RuCHMO-Oligo</span></big>

=== 1. RuCHMO 制备===
{| class="wikitable" style="text-align:center;width:80%"
|-
! 样品 !! 初始浓度 !! 取样量 !! 最终浓度 !! 最终体积
|-
| '''<span style="color:red;">RuCHMO</span>''' || 28.2 μM || 100 μL || 5 μM || 564 μl
|}
* 最终样品 分为 '''4份''' 每份 '''140 ul'''
=== 2. 向 100 ul RuCHMO 样品液中加入 DBCO，'''4℃冰箱中冰浴孵育 4 h''' ===
{| class="wikitable" style="text-align:center; width:90%"
! 样品 !! 最终浓度 !! 分子量 !! 总摩尔量 !! Eq DBCO !! DBCO 摩尔量 !! DBCO 加入量 !! 总体积
|-
| RuCHMO || 5 μM || 65.45 kDa || 0.5 nMol || 20 Eq || 10 nMol || 1 μL || 100 μL
|}

=== 3. 4 ℃, 12000 转, 超滤 20 min ===
=== 4. 加入 Oligo，并在 4 ℃冰箱 冰浴下孵育 过夜 ===
{| class="wikitable" style="text-align:center; width:90%"
! 样品 !! 总摩尔量 !! Eq Oligo !! Oligo 摩尔量 !! S1 加入量 !! 总体积
|-
| RuCHMO || 0.5 nMol || 20 Eq || 10 nMol || 10 μL || 100 μL
|}

===<big> '''二、Nativepage''' </big>===
[[File:reference_of_gel_concentration.jpg|thumb|600px|Reference]]

===1. 制胶 ===
{| class="wikitable"
|-
! 成分
! 体积/质量
|-
| 30% ACR: Bis(29:1)
| 4.8 ml
|-
| Tris 1.5M
| 2 ml
|-
| 10% APS
| 80 ul
|-
| TEMED
| 8 ul
|-
| '''总'''
| '''8 ml'''
|}

'''注：''' 浓度'''(ACr)'''计算公式为 (30% × 4.8) / 8
*'''1.5mol/L Tris (ph8.8):36.3g Tris /200 ml UP 水'''
*''' 10%APS:0.5 g APS / 5 ml UP 水，分装冻存

===2. 缓冲液配置 ===
* '''10X TBE (1L)'''
{| class="wikitable"
|-
! 成分
! 质量
|-
| Tris
| 54 g
|-
| EDTA-Na₂
| 3.72 g
|-
| 硼酸
| 27.5 g
|}

* 调节 PH 至 '''8.3'''

=== 3.上样液：蛋白缓冲液 = 4:1 ===
=== 4. 染色 ===
*切取胶体放置于含 '''10 ml 考马斯亮蓝'''培养皿中， '''37℃ 摇床振摇 3-4 h'''
*待颜色稳定后，吸出考马斯亮蓝溶液，可循环使用 2-3 次，用''' UP 水反复清洗至基底原色'''