Editing 蛋白提取及WB

<div style="color: black !important; font-family: 'Times New Roman', SimSun, serif !important;">


*前处理-蛋白提取；
*分离：SDS-PAGE
*成像：转膜、WB
==蛋白提取==
#弃去贴壁细胞的培养基，1 mLPBS清洗，弃去，加入400 ulPBS，
#胰酶或者细胞刮板分离底部粘璧cell，移液枪转移至上述ep管中。流式不可采用刮板，会损伤cell；样品间刮板用PBS清洗；
#配制细胞裂解液：配制100 mM的PMSF in IPA，临用前1：100加入用商品化的细胞裂解液。 
#按照12孔板每孔cell加入25 ul细胞裂解液的比例向ep管加入cell裂解液，4 ℃裂解10-30min、14k rpm离心15min。（6孔板每孔50ul裂解液）
#可取部分上清用于BCA测定
#用上清稀释loading buffer(按照商品化loading buffer 的要求），金属浴or沸水浴 5 - 10min，防止ep管加热过程开盖
#分装，-40--80℃保存，防止降解。

==BCA测总蛋白==
#试剂配制
##试剂A：将10g BCA（二辛可宁酸）、20g Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>H<sub>2</sub>O、6g Na<sub>2</sub>C<sub>4</sub>H<sub>4</sub>O<sub>6</sub>2H<sub>2</sub>O、4g NaOH和5g NaHCO3溶解于1 L蒸馏水中，NaOH或Na2CO3调节pH值至11.25。
##试剂B：取2g CuSO<sub>4</sub> 5H<sub>2</sub>O溶解于蒸馏水中，定容至50ml。
##BCA工作液：试剂A:试剂B=50:1混匀，可稳定一周。
##标准蛋白质溶液:0.5mg/ml的BSA水溶液。
#实验操作
##PBS稀释组织样品5-10倍
##校正标样（n=3）的制备：将0.5mg/ml的BSA水溶液分别取0、1、2、4、8、12、16、20 uL至96孔板中。加PBS补足至20 ul。（蛋白浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL）。浓度可按需调整，该方法LLOQ为0.01 mg/mL
##20μl的样品溶液（n=3）加入到96孔酶标板中
##每孔加入200μL BCA工作液，
##37℃孵育20~30min
##自然冷却至室温。
##吸光度测定：在562nm下酶标仪比色测定，同时以空白孔作为参照。

==SDS-PAGE==
===制胶===
<ol type="1">
 <li>支架下方垫橡胶垫实现密封，薄板朝外装载玻璃板，对准刻度（吸头辅助夹紧）[[File:SDS-PAGE制胶装置.jpg|center|thumb|300px|SDS-PAGE制胶装置]]
 <li>配制电泳液：每次用量约1.5 L
<table class="wikitable" style="margin: auto; border-collapse: collapse; border: 1px solid #a2a9b1;">
  <tr>
 <th colspan="2">1.5L SDS-PAGE电泳液组成</td>
  </tr>
  <tr>
  <th>Reagent</td>
<th>Quantity (for 1.5 L)</td>
  <tr>
  <td> Tris</td>
<td>4.545 g</td>
 <tr>
  <td> 甘氨酸</td>
<td>21.6 g</td>
 <tr>
  <td>SDS</td>
<td>1.5 g</td>
  <tr>
  <td> UP水</td>
<td>1.5 L
</tr>
 </table>
 <li>根据目标蛋白的分子量，按照商品化制胶试剂说明书调配试剂，制作分离胶和浓缩胶，倒入玻璃板，分离胶灌至距绿边1cm，浓缩胶灌满，插入梳子（刻度向外），注意观察梳齿气泡。[[File:SDS-PAGE凝胶比例.jpg|center|thumb|300px|SDS-PAGE凝胶比例]]
 <li>凝固后，将玻璃板转移至电泳槽中，薄板向里，薄板上沿对齐标线，下沿不用触底，向夹层中倒入电泳液，验漏(是否夹紧，否则电泳时功率不稳)
 <li>拔出梳子，用加样吸头吸取电泳液清洗样品孔，排气泡以及排除残余胶液

 <li>上样及marker，一般1孔20ug，最多30ul，10孔梳10-15 ul/孔，15孔梳7-10 ul/孔；最侧边的孔及空余孔上样 1xloading buffer(电泳液稀释)
 <li>电泳电压：浓缩胶约90V（W约为4W）,分离胶约150V（W约为8W），室温
 <li>溴酚蓝迁移至凝胶2/3处即可停止电泳[[File:SDS-PAGE电泳例图.jpg|center|thumb|300px|SDS-PAGE电泳例图]]
</ol>
===转膜===
<ol type="1">
 <li>转膜缓冲液的配制：
<table class="wikitable" style="margin: auto; border-collapse: collapse; border: 1px solid #a2a9b1;">
  <tr>
    <th colspan="2">1.5L 转膜缓冲液组成</th>
  </tr>
  <tr>
    <th>Reagent</th>
    <th>Quantity (for 1.5 L)</th>
  </tr>
  <tr style="border-top: 1px solid #a2a9b1;">
    <td>Tris</td>
    <td>4.545 g</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>甘氨酸</td>
    <td>21.6 g</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>UP水</td>
    <td>1.2 L</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>乙醇</td>
    <td>300 mL*</td>
  </tr>
  <tr style="border-top: 1px solid #a2a9b1;">
    <td colspan="2"><i>*：乙醇待水溶液体系完全溶解后再加入</i></td>
  </tr>
</table>
<li>PVDF膜及其支撑膜浸入乙醇中活化5 min；转入转膜缓冲液浸泡；可在膜右上角剪口分辨方向
<li>转膜缓冲液倒入盘中，各层预先在盘中浸透
<li>黑色在下，按照海绵（层数可增加，能夹紧即可）-1层滤纸-gel(切割周围)-膜-1层滤纸-海绵，进行叠加，注意覆盖转膜液排出气泡，夹紧，按照标识放入电泳槽
<li>4 ℃冰水浴，300 mAh，电泳约50 min
</ol>

===WB===
[[File:WB实验.jpg|center|thumb|300px|WB实验]]
<ol>
<li>剪裁目标蛋白和参比蛋白的膜，浸入封闭液中，摇床15min（按封闭剂的种类）
<li>TBST配制：
<table class="wikitable" style="margin: auto; border-collapse: collapse; border: 1px solid #a2a9b1;">
  <tr>
    <th colspan="2">0.5L TBST缓冲液组成</th>
  </tr>
  <tr>
    <th>Reagent</th>
    <th>Quantity (for 0.5 L)</th>
  </tr>
  <tr style="border-top: 1px solid #a2a9b1;">
    <td>Tris</td>
    <td>1.21 g</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>NaCl</td>
    <td>4 g</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>UP水*</td>
    <td>0.5 L</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>吐温20**</td>
    <td>2.5 mL（0.5%）</td>
  </tr>
  <tr style="border-top: 1px solid #a2a9b1;">
<td colspan="2"><i>*：Tris和NaCl溶解后HCl调整pH至7.6（pH计）</i></td></tr>
<tr style="border-top: 1px solid #a2a9b1;">
<td colspan="2"><i>**：调完pH再加吐温，使用用特殊的枪和吸头</i></td></tr>
     
</tr>
</table>
<li>回收封闭液,TBST清洗5次(摇床5 min）
<li>加一抗5ml（用3%脱脂奶粉in TBST按照说明书稀释），膜浸透，避免漂浮或粘壁，37度摇床1h，4℃过夜
<li>回收一抗，膜用TBST清洗5次，每次摇床5min后弃去，去除残余一抗
<li>加入二抗（用3%脱脂奶粉稀释），37度摇床1h，TBST清洗5次，最后将膜保存在TBST中 
<li>使用314的BioRad凝胶成像系统，image lab软件，将缓冲液中保存的膜浸泡至显影液（按说明书配制）中2min，转移至培养皿，放入样品盘，成像
<li>仪器：
<ol>
<li>开机：插排-稳压电源-仪器-电脑（关机反方向）
<li>image lab软件:运行软件-确定-select scanner-chom...-select-chem Hi sentilye(取消VVA勾选）
[[File:WB结果例图.png|center|thumb|300px|WB结果例图]]

==备注==
#实验操作：
##制胶前用70%乙醇清洁并擦拭玻璃板，提前洗净烘干。
##内参一般不和样品同一块膜，单染方便抗体回收，只回收一抗，不回收二抗。一抗多为兔种属，二抗是抗兔的山羊抗，二抗基本只针对一抗的种属。抗体一般-20℃保存。
##对于悬浮cell或者出现悬浮现象的贴壁细胞，直接移液枪转移12孔板中cell培养液到ep管中，底部留存部分液态培养基用于刮板转移，离心2k rpm 3min，弃去上清，PBS重悬，n合1，再次离心，弃上清，清洗cell，重悬。加入细胞裂解液。
##制好的胶尽快使用，若需隔夜可将凝胶置于电泳缓冲液中过夜
##上层溶液左中右位点均匀加入
##该测定实验本身影响因素较多，所以n个重复合成一个样本进行SDS-PAGE，一组样本尽量一块凝胶进行分析。
##预实验可省略bca，根据细胞密度简单确定上样体积，使用内参(cell固定表达蛋白，且相对量较为固定）进行相对定量。常用内参：
###GAPDH，参与糖酵解的酶，37 kD
###β-Actin，广泛分布于各种组织中的肌动蛋白，42 kD
###实验室配制loading buffer：
###实验室配制试剂：

<table class="wikitable" style="margin: auto; border-collapse: collapse; border: 1px solid #a2a9b1;">
  <tr>
    <th colspan="2">Loading buffer上样缓冲液</th>
  </tr>
  <tr>
    <th>Reagent</th>
    <th>Quantity </th>
  </tr>
  <tr style="border-top: 1px solid #a2a9b1;">
    <td>Tris</td>
    <td>3.8 g</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>10%SDS</td>
    <td>10 mL</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>甘油</td>
    <td>10 mL</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>溴酚蓝</td>
    <td>0.05 g</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>UP水</td>
    <td>100 mL</td>   
</tr>
  <tr>
    <td>巯基乙醇</td>
    <td>临用前加入，巯基乙醇：与前述溶液按照=1：3混合</td>   
</tr>
</table>


<table class="wikitable" style="margin: auto; border-collapse: collapse; border: 1px solid #a2a9b1;">
    <tr>
      <th colspan="2">分离胶</th>
    </tr>
    <tr>
      <th>Reagent</th>
      <th>Quantity（5mL/板）</th>
    </tr>
    <tr>
      <td>H₂O</td>
      <td>1 mL</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>30%Arc - Bis</td>
      <td>2 mL</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1 M Tris（pH 8.8）</td>
      <td>1.9 mL</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>10% SDS</td>
      <td>0.05 mL</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>10%过硫酸铵（APS）</td>
      <td>0.05 mL</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>TEMED</td>
      <td>2 uL</td>
    </tr>
</table>


<table class="wikitable" style="margin: auto; border-collapse: collapse; border: 1px solid #a2a9b1;">
    <tr>
      <th colspan="2">浓缩胶</th>
    </tr>
    <tr>
      <th>Reagent</th>
      <th>Quantity（5mL/板）</th>
    </tr>
    <tr>
      <td>H₂O</td>
      <td>2.1 mL</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>30%Arc - Bis</td>
      <td>0.5 mL</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1 M Tris（pH 6.8）</td>
      <td>0.38 mL</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>10% SDS</td>
      <td>0.03 mL</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>10%过硫酸铵（APS）</td>
      <td>0.03 mL</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>TEMED</td>
      <td>3 uL</td>
    </tr>
</table>
*实验室制胶方法：先配制并灌注分离胶至绿边下缘1cm，均匀加UP水液封，静置1h直至分界线明显，配制浓缩胶，倒掉液封水，并用滤纸吸干，灌注浓缩胶，插入梳子，静置1h，拔下梳子并加缓冲液排气泡，静置30 min后再上样

#其他：
##该实验用于药效评估，药效前应当先做毒性实验
##细胞裂解液的成分：pmsf
##封闭液的组成：BSA或5%脱脂奶粉溶液
##实验室制胶：

==原理==
<ol>
<li>SDS-PAGE原理<br>

阴离子与蛋白质按比例（摩尔比）结合带上负电荷（SDS数量远超蛋白本身电荷数），消除蛋白质原有的电荷差异。SDS破坏蛋白质的氢键、疏水作用力等非共价键，破坏高级结构，解离为蛋白质亚基，蛋白质解聚为单体。（m/z决定电泳结果，即只与蛋白质分子量有关，而与电荷和分子形态无关）。为了确保蛋白质在电泳过程中处于变性展开状态，并且始终带有负电荷，在凝胶蛋白质样品和凝胶缓冲液中，都需要添加SDS。
<li>SDS-PAGE Loading buffer<br>

主要含有SDS、甘油、β-巯基乙醇（β-ME）、带负电荷的染料(常用溴酚蓝)，甘油可以使蛋白样品密度大于电泳缓冲液而沉入梳底。Β-巯基乙醇可以打开二硫键。而带有负电荷的染料，其分子量小于绝大多数的分子样品。迁移速率最快。样品制备好以后，上样之前需要将其加热5分钟，而使其变性展开。
<li>浓缩胶和分离胶
丙烯酰胺(Arc)和甲叉双丙烯酰胺(Bis，作为聚丙烯酰胺的linker，形成孔洞结构)在催化剂(过硫酸铵，形成自由基)和加速剂（TEMD，二（N-二甲基）乙二胺，加速催化剂形成自由基）的作用下，形成的一种三维网状结构，允许蛋白质通过。可以通过改变丙烯酰胺的浓度来改变孔径的大小。高浓度凝胶孔径小，利于分离小分子蛋白；低浓度的凝胶孔径大，利于分离大分子蛋白。
<ol>
<li>电泳缓冲液：pH 8.3，含有SDS、Cl<sup>-</sup>和甘氨酸（pI 5.97）。
<li>上层浓缩胶：pH 6.8，孔径大，样品先进入浓缩胶，形成很窄的条带。因为甘氨酸显示电中性，与负电的Cl<sup>-</sup>挤压蛋白质，使得条带变窄
<li>下层分离胶：pH 8.8，孔径小，通过分子筛分离蛋白质。
 </ol>
<li>成像原理<br>

增强化学发光法（ECL）：显影剂含有H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>和鲁米诺（或其衍生物），二抗上的HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光。稳定性好，灵敏度高，成像性好，对仪器设备无特殊要求，是目前最常用的显影方法。
<li>细胞裂解液<br>
主要是表面活性剂，破坏生物膜。RIPA含有SDS，脱氧胆酸钠，TritonX-100的混合溶液。
<table class="wikitable" style="margin: auto; border-collapse: collapse; border: 1px solid #a2a9b1;"><tr><th>蛋白定位</th><th>裂解液种类</th></tr><tr><td>全细胞</td><td>NP - 40 或 RIPA</td></tr><tr><td>细胞质（可溶性蛋白）</td><td>Tris - HCL</td></tr><tr><td>细胞质（细胞骨架等不溶性蛋白）</td><td>Tris - Triton</td></tr><tr><td>细胞膜</td><td>NP - 40 或 RIPA</td></tr><tr><td>细胞核</td><td>RIPA</td></tr><tr><td>线粒体</td><td>RIPA</td></tr></table>
<li>BCA测蛋白原理：
在碱性环境下，蛋白质能促使试剂中的铜离子（Cu2+）还原为单价铜离子（Cu+）。Cu+离子与BCA发生螯合反应，生成一种稳定的水溶性的蓝紫色的络合物，562纳米波长处具有强烈的吸光性。借助标准曲线定量。
<li>转膜原理
电转印是蛋白免疫印迹中最常见的转印方法，即使用电场力驱动蛋白从凝胶中洗脱转移到膜上。聚偏二氟乙烯（PVDF）。具有很强的蛋白结合能力，大多数免疫印迹实验，可使用孔径为0.45 μm的膜，0.2 μm孔径的膜适合转印低分子量蛋白 (<15,000 kD)，低分子蛋白有可能穿过较大孔径的印迹膜。转膜时，凝胶中的样品由负极移向正极，到达膜的表面，与蛋白稳定结合，方便后续进行抗体孵育。

</ol>



</div>