Editing 蛋白提取及WB (section)

==原理==
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<li>SDS-PAGE原理<br>

阴离子与蛋白质按比例（摩尔比）结合带上负电荷（SDS数量远超蛋白本身电荷数），消除蛋白质原有的电荷差异。SDS破坏蛋白质的氢键、疏水作用力等非共价键，破坏高级结构，解离为蛋白质亚基，蛋白质解聚为单体。（m/z决定电泳结果，即只与蛋白质分子量有关，而与电荷和分子形态无关）。为了确保蛋白质在电泳过程中处于变性展开状态，并且始终带有负电荷，在凝胶蛋白质样品和凝胶缓冲液中，都需要添加SDS。
<li>SDS-PAGE Loading buffer<br>

主要含有SDS、甘油、β-巯基乙醇（β-ME）、带负电荷的染料(常用溴酚蓝)，甘油可以使蛋白样品密度大于电泳缓冲液而沉入梳底。Β-巯基乙醇可以打开二硫键。而带有负电荷的染料，其分子量小于绝大多数的分子样品。迁移速率最快。样品制备好以后，上样之前需要将其加热5分钟，而使其变性展开。
<li>浓缩胶和分离胶
丙烯酰胺(Arc)和甲叉双丙烯酰胺(Bis，作为聚丙烯酰胺的linker，形成孔洞结构)在催化剂(过硫酸铵，形成自由基)和加速剂（TEMD，二（N-二甲基）乙二胺，加速催化剂形成自由基）的作用下，形成的一种三维网状结构，允许蛋白质通过。可以通过改变丙烯酰胺的浓度来改变孔径的大小。高浓度凝胶孔径小，利于分离小分子蛋白；低浓度的凝胶孔径大，利于分离大分子蛋白。
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<li>电泳缓冲液：pH 8.3，含有SDS、Cl<sup>-</sup>和甘氨酸（pI 5.97）。
<li>上层浓缩胶：pH 6.8，孔径大，样品先进入浓缩胶，形成很窄的条带。因为甘氨酸显示电中性，与负电的Cl<sup>-</sup>挤压蛋白质，使得条带变窄
<li>下层分离胶：pH 8.8，孔径小，通过分子筛分离蛋白质。
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<li>成像原理<br>

增强化学发光法（ECL）：显影剂含有H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>和鲁米诺（或其衍生物），二抗上的HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光。稳定性好，灵敏度高，成像性好，对仪器设备无特殊要求，是目前最常用的显影方法。
<li>细胞裂解液<br>
主要是表面活性剂，破坏生物膜。RIPA含有SDS，脱氧胆酸钠，TritonX-100的混合溶液。
<table class="wikitable" style="margin: auto; border-collapse: collapse; border: 1px solid #a2a9b1;"><tr><th>蛋白定位</th><th>裂解液种类</th></tr><tr><td>全细胞</td><td>NP - 40 或 RIPA</td></tr><tr><td>细胞质（可溶性蛋白）</td><td>Tris - HCL</td></tr><tr><td>细胞质（细胞骨架等不溶性蛋白）</td><td>Tris - Triton</td></tr><tr><td>细胞膜</td><td>NP - 40 或 RIPA</td></tr><tr><td>细胞核</td><td>RIPA</td></tr><tr><td>线粒体</td><td>RIPA</td></tr></table>
<li>BCA测蛋白原理：
在碱性环境下，蛋白质能促使试剂中的铜离子（Cu2+）还原为单价铜离子（Cu+）。Cu+离子与BCA发生螯合反应，生成一种稳定的水溶性的蓝紫色的络合物，562纳米波长处具有强烈的吸光性。借助标准曲线定量。
<li>转膜原理
电转印是蛋白免疫印迹中最常见的转印方法，即使用电场力驱动蛋白从凝胶中洗脱转移到膜上。聚偏二氟乙烯（PVDF）。具有很强的蛋白结合能力，大多数免疫印迹实验，可使用孔径为0.45 μm的膜，0.2 μm孔径的膜适合转印低分子量蛋白 (<15,000 kD)，低分子蛋白有可能穿过较大孔径的印迹膜。转膜时，凝胶中的样品由负极移向正极，到达膜的表面，与蛋白稳定结合，方便后续进行抗体孵育。

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