Editing 蛋白提取及WB (section)

==SDS-PAGE==
===制胶===
<ol type="1">
 <li>支架下方垫橡胶垫实现密封，薄板朝外装载玻璃板，对准刻度（吸头辅助夹紧）[[File:SDS-PAGE制胶装置.jpg|center|thumb|300px|SDS-PAGE制胶装置]]
 <li>配制电泳液：每次用量约1.5 L
<table class="wikitable" style="margin: auto; border-collapse: collapse; border: 1px solid #a2a9b1;">
  <tr>
 <th colspan="2">1.5L SDS-PAGE电泳液组成</td>
  </tr>
  <tr>
  <th>Reagent</td>
<th>Quantity (for 1.5 L)</td>
  <tr>
  <td> Tris</td>
<td>4.545 g</td>
 <tr>
  <td> 甘氨酸</td>
<td>21.6 g</td>
 <tr>
  <td>SDS</td>
<td>1.5 g</td>
  <tr>
  <td> UP水</td>
<td>1.5 L
</tr>
 </table>
 <li>根据目标蛋白的分子量，按照商品化制胶试剂说明书调配试剂，制作分离胶和浓缩胶，倒入玻璃板，分离胶灌至距绿边1cm，浓缩胶灌满，插入梳子（刻度向外），注意观察梳齿气泡。[[File:SDS-PAGE凝胶比例.jpg|center|thumb|300px|SDS-PAGE凝胶比例]]
 <li>凝固后，将玻璃板转移至电泳槽中，薄板向里，薄板上沿对齐标线，下沿不用触底，向夹层中倒入电泳液，验漏(是否夹紧，否则电泳时功率不稳)
 <li>拔出梳子，用加样吸头吸取电泳液清洗样品孔，排气泡以及排除残余胶液

 <li>上样及marker，一般1孔20ug，最多30ul，10孔梳10-15 ul/孔，15孔梳7-10 ul/孔；最侧边的孔及空余孔上样 1xloading buffer(电泳液稀释)
 <li>电泳电压：浓缩胶约90V（W约为4W）,分离胶约150V（W约为8W），室温
 <li>溴酚蓝迁移至凝胶2/3处即可停止电泳[[File:SDS-PAGE电泳例图.jpg|center|thumb|300px|SDS-PAGE电泳例图]]
</ol>
===转膜===
<ol type="1">
 <li>转膜缓冲液的配制：
<table class="wikitable" style="margin: auto; border-collapse: collapse; border: 1px solid #a2a9b1;">
  <tr>
    <th colspan="2">1.5L 转膜缓冲液组成</th>
  </tr>
  <tr>
    <th>Reagent</th>
    <th>Quantity (for 1.5 L)</th>
  </tr>
  <tr style="border-top: 1px solid #a2a9b1;">
    <td>Tris</td>
    <td>4.545 g</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>甘氨酸</td>
    <td>21.6 g</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>UP水</td>
    <td>1.2 L</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>乙醇</td>
    <td>300 mL*</td>
  </tr>
  <tr style="border-top: 1px solid #a2a9b1;">
    <td colspan="2"><i>*：乙醇待水溶液体系完全溶解后再加入</i></td>
  </tr>
</table>
<li>PVDF膜及其支撑膜浸入乙醇中活化5 min；转入转膜缓冲液浸泡；可在膜右上角剪口分辨方向
<li>转膜缓冲液倒入盘中，各层预先在盘中浸透
<li>黑色在下，按照海绵（层数可增加，能夹紧即可）-1层滤纸-gel(切割周围)-膜-1层滤纸-海绵，进行叠加，注意覆盖转膜液排出气泡，夹紧，按照标识放入电泳槽
<li>4 ℃冰水浴，300 mAh，电泳约50 min
</ol>

===WB===
[[File:WB实验.jpg|center|thumb|300px|WB实验]]
<ol>
<li>剪裁目标蛋白和参比蛋白的膜，浸入封闭液中，摇床15min（按封闭剂的种类）
<li>TBST配制：
<table class="wikitable" style="margin: auto; border-collapse: collapse; border: 1px solid #a2a9b1;">
  <tr>
    <th colspan="2">0.5L TBST缓冲液组成</th>
  </tr>
  <tr>
    <th>Reagent</th>
    <th>Quantity (for 0.5 L)</th>
  </tr>
  <tr style="border-top: 1px solid #a2a9b1;">
    <td>Tris</td>
    <td>1.21 g</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>NaCl</td>
    <td>4 g</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>UP水*</td>
    <td>0.5 L</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>吐温20**</td>
    <td>2.5 mL（0.5%）</td>
  </tr>
  <tr style="border-top: 1px solid #a2a9b1;">
<td colspan="2"><i>*：Tris和NaCl溶解后HCl调整pH至7.6（pH计）</i></td></tr>
<tr style="border-top: 1px solid #a2a9b1;">
<td colspan="2"><i>**：调完pH再加吐温，使用用特殊的枪和吸头</i></td></tr>
     
</tr>
</table>
<li>回收封闭液,TBST清洗5次(摇床5 min）
<li>加一抗5ml（用3%脱脂奶粉in TBST按照说明书稀释），膜浸透，避免漂浮或粘壁，37度摇床1h，4℃过夜
<li>回收一抗，膜用TBST清洗5次，每次摇床5min后弃去，去除残余一抗
<li>加入二抗（用3%脱脂奶粉稀释），37度摇床1h，TBST清洗5次，最后将膜保存在TBST中 
<li>使用314的BioRad凝胶成像系统，image lab软件，将缓冲液中保存的膜浸泡至显影液（按说明书配制）中2min，转移至培养皿，放入样品盘，成像
<li>仪器：
<ol>
<li>开机：插排-稳压电源-仪器-电脑（关机反方向）
<li>image lab软件:运行软件-确定-select scanner-chom...-select-chem Hi sentilye(取消VVA勾选）
[[File:WB结果例图.png|center|thumb|300px|WB结果例图]]