琼脂糖凝胶电泳

原理

1. 分离：电泳（分子量，构象）+类似分子筛(小分子更快)
2. 成像：制胶溶液中的荧光分子和DNA结合

操作

1. 参考实验视频：https://www.bilibili.com/video/BV1UR4y1x7ng/
2. 制胶：
   1. 向锥形瓶中加入适量琼脂糖干粉和TAE电泳缓冲液50mL（Tris，乙酸，EDTA）
   2. 加热溶解，可超声or加磁力搅拌子煮沸
   3. 冷却至60℃，冷却过程中摇晃or搅拌，避免底部先凝固，并及时挑出液面的凝胶膜和气泡
   4. 冷却至不烫手后加入核酸染料（DNA goldview，注意避光），混匀，倒入凝胶模具（约厚3~5mm），挑去气泡或将气泡引至上样孔对侧。

琼脂糖凝胶模具示意图

1. 1. 室温冷却凝固（约30 min），拔出梳子，将凝胶及托盘转移至电泳槽中。向电泳槽中加入电泳缓冲液（约没过凝胶 2-3mm）。
   2. 加样：
   3. 样品：PBS or 超纯水稀释DNA样品至约50 ug/mL，吸取载样缓冲液（loading Buffer，LB，含有溴酚蓝）和样品混匀并上样10 uL至加样孔2，3…（上样量：8孔梳载样20 ul，16孔梳载样10ul）
   4. DNA Marker：含有不同分子量的标准品，可省略添加LB步骤。加载至gel加样孔（可置于开头、末尾、中间孔）。
2. 电泳
   1. 电泳槽置于冰水浴中，利于DNA样品稳定。
   2. DNA含有磷酸基团带负电荷，由负极向正极泳动，150 V，负极出现气泡，电压可中途调整。

琼脂糖凝胶电泳示意图

1. 1. 12-15 min，一般溴酚蓝迁移至gel约2/3处停止电泳,取出电泳槽中的凝胶及托盘。
2. 成像
   1. 使用314的BioRad凝胶成像系统，image lab软件
   2. 从托盘中取出凝胶放置于样品盘中，选择通道<gold>，调整滤光片，观察显色。

琼脂糖凝胶结果图

备注

1. 50×TAE Buffer 配制方法
   1. 称量Tris 242 g和Na₂EDTA·2H₂O 37.2 g于1 L烧杯中；
   2. 向烧杯中加入约600 ml去离子水，充分搅拌溶解；
   3. 加入57.1 ml的冰乙酸，充分搅拌;
   4. 加去离子水定容至1 L后，室温保存。

Na+离子0.01-0.04 M，浓度太低时电泳速度变慢；太高会造成过大的电流使胶发热甚至熔化；EDTA 1-2 M，目的是螯合Mg2+，防止电泳时激活DNA酶，以及防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。

1. 长链DNA：电泳缓冲液还需要加Mg2+，稳定DNA
2. loading buffer
   1. 避免DNA上浮；
   2. 与样品的比例按照buffer的说明书
   3. 含有溴酚蓝，电泳时在最前沿
3. 核酸染料gold view
   1. 需要避光，在加入后的制胶和电泳过程中，都关灯或黑色塑料袋遮光进行：